郭秀玲

(鄭州華信學(xué)院，河南 鄭州451150)

喉鱗狀細胞癌是人類頭頸部好發(fā)的惡性腫瘤之一，目前其主要的治療方法是手術(shù)、放療、化療，但療效均不夠理想。RNA 干擾技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的基因沉默技術(shù)，其原理是利用雙鏈RNA 特異性降解具有同源序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因的表達［1］。RNA 干擾具有高效、高特異性等優(yōu)點，為多種疾病，特別是惡性腫瘤的治療開拓了新思路，因此尋找和發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細胞癌新的預(yù)后和治療基因顯得十分重要。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是P13K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游有效蛋白之一，可以整合氨基酸、能量、生長因子所激發(fā)的信號通路，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、核糖體生物合成和細胞生長、細胞凋亡、細胞遷移等生理過程，而這些過程都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤伴有mTOR 信號通路調(diào)節(jié)異常。雷帕霉素能特異性靶向抑制mTOR，從而抑制細胞生長。研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能抑制部分腫瘤細胞株，其中對乳腺癌、卵巢癌、白血病、肺癌、腎癌等腫瘤細胞株的生長抑制明顯。本研究通過轉(zhuǎn)染mTOR siRNA 及應(yīng)用雷帕霉素于喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞后一些指標(biāo)的變化，觀察mTOR siRNA 對mTOR 蛋白表達及細胞增殖能力的影響，以期為喉鱗狀細胞癌的分子治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的45 例喉鱗狀細胞癌組織和45 例正常喉黏膜組織標(biāo)本，并采用免疫組織化學(xué)法檢測其mTOR 蛋白的表達。

1.2 細胞系 人喉鱗狀細胞癌細胞系Hep-2 購自上海中科院細胞庫，在含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長，并置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的條件下培養(yǎng)，實驗細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 主要試劑 mTOR siRNA、對照siRNA、mTOR 抗體、β-actin 均購自美國Santa Cruz 公司;CCK-8 試劑盒購自中國Beyotime 生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 將喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞復(fù)蘇培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，根據(jù)mTOR siRNA 治療情況，將細胞分為5 組:空白對照組(不作任何處理)、空載體組(利用對照siRNA 進行治療)和3 個mTOR siRNA組(利用mTOR siRNA 進行治療，低、中、高濃度組mTOR siRNA 濃度分別為50、100、150 nmol·L-1);根據(jù)雷帕霉素治療情況，將細胞分為5 組:正常對照組、溶劑對照組和3 個雷帕霉素組(低、中、高濃度組雷帕霉素濃度分別為100、150、200 nmol·L-1)。

1.4.2 Western bolting 法檢測蛋白 于24、48、72 h分別收集mTOR siRNA 及雷帕霉素處理后各組喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞，加入蛋白裂解液，勻漿后12 000 ×g低溫離心30 min，取上清液，測定蛋白濃度。采用質(zhì)量分數(shù)10% SDS-PAGE 進行蛋白電泳，蛋白上樣量為每孔60 μg，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入1∶200稀釋的mTOR 抗體，4 ℃反應(yīng)過夜，洗膜后，加入1∶5 000 稀釋的二抗室溫反應(yīng)1 h，暗室曝光，結(jié)果采用Gene Tools 軟件進行蛋白相對表達分析。

1.4.3 CCK-8 法檢測細胞增殖情況 于24、48、72 h分別收集mTOR siRNA 處理后各組喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞，每孔加入10 μL CCK-8 溶液(加入的體積一般為原來培養(yǎng)液體積的10%);細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 ～4 h，于酶標(biāo)儀上測定450 nm 處吸光度，并繪制喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞的增殖曲線。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有的結(jié)果采用SPSS 13.0 進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)以±s表示，2 組數(shù)據(jù)間比較用獨立樣本t檢驗，3 組及以上數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗;計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細胞癌組織和正常喉黏膜組織中mTOR蛋白的表達 mTOR 蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中，陽性信號呈不同程度的黃色。mTOR 蛋白在喉鱗狀細胞癌組織中表達的陽性率顯著高于正常喉黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 mTOR 蛋白在喉鱗狀細胞癌組織和正常喉黏膜組織中的表達

圖1 mTOR 在喉鱗狀細胞癌組織和正常喉黏膜組織中的表達(DAB，×200)

2.2 mTOR siRNA 對喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞中mTOR 蛋白表達的影響 3 種不同濃度的mTOR siRNA 分別轉(zhuǎn)染喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞24、48、72 h，與空白對照組、空載體組相比，mTOR siRNA 轉(zhuǎn)染的各組各時點mTOR 蛋白的表達均明顯降低(P＜0.05)，且mTOR 蛋白的表達隨mTOR siRNA 濃度的增加、處理時間的延長而減低(P＜0.05);各時點空白對照組與空載體組mTOR 蛋白的表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2、圖2。

表2 mTOR siRNA 轉(zhuǎn)染組mTOR 蛋白的表達情況

圖2 mTOR siRNA 高濃度組處理72 h 后mTOR 蛋白的表達情況

2.3 雷帕霉素對喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞中mTOR 蛋白表達的影響 3 種不同濃度的雷帕霉素處理喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞24、48、72 h，各組各時點與溶劑對照組及正常對照組相比，mTOR 蛋白的表達量均有所降低(P＜0.05);且mTOR 蛋白的表達隨雷帕霉素濃度的增加、處理時間的延長而降低(P＜0.05);溶劑對照組及正常對照組mTOR 蛋白的表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3、圖3。

表3 各雷帕霉素組mTOR 蛋白的表達

圖3 雷帕霉素高濃度組處理72 h 后mTOR 蛋白的表達情況

2.4 mTOR siRNA 對喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞增殖能力的影響 利用CCK-8 分析轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞增殖的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組、空載體組相比，各mTOR siRNA 組喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞的增殖在轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h 均受到明顯抑制(P＜0.05);空白對照組、空載體組在轉(zhuǎn)染后監(jiān)測的各時點細胞增殖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖4。

圖4 mTOR siRNA 處理后喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞增殖情況

3 討論

腫瘤的發(fā)生進展非常復(fù)雜，其機制與眾多的生長因子信號通路異常有關(guān)。單獨利用分子靶向藥物或與其他治療方式聯(lián)合應(yīng)用，對這些生長因子信號通路進行分子靶向治療將有助于形成一種新的腫瘤生物治療模式。分子靶向治療能夠特異性作用于腫瘤信號通路中的關(guān)鍵靶點，阻斷相關(guān)信號的傳遞以影響腫瘤細胞的生長和代謝，進而達到治療腫瘤的目的［6-8］。

mTOR 屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)的蛋白激酶超家族成員，作為Ser/Thr 激酶而起作用。mTOR 信號通路被認為是一個調(diào)節(jié)細胞周期進程和細胞生長的信號匯聚點。由于mTOR 在細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和存活中的重要地位，mTOR 已經(jīng)成為腫瘤治療中的一個新靶點［9-10］。

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能特異性靶向抑制mTOR，具有靶向抗腫瘤細胞作用，可將腫瘤細胞阻滯在G1期，使腫瘤細胞生長受抑制并最終阻滯細胞的增殖，甚至誘導(dǎo)細胞凋亡，同時也能抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。雷帕霉素對不同腫瘤細胞株的抑制作用不一，同一腫瘤的不同細胞株之間對雷帕霉素的敏感度也存在差異［11］。因此，本研究利用RNA 干擾技術(shù)及雷帕霉素作用于喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞，通過觀察其mTOR 蛋白表達及增殖能力的變化，以期為喉鱗狀細胞癌的分子治療提供理論依據(jù)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 在喉鱗狀細胞癌組織中高表達，在正常喉黏膜組織中低表達。而mTOR 在喉鱗狀細胞癌組織中的高表達提示在臨床治療中使用mTOR 抑制劑治療可能獲得較好的治療效果。應(yīng)用3種不同濃度的mTOR siRDA 和雷帕霉素處理喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞，發(fā)現(xiàn)mTOR siRNA 和雷帕霉素能下調(diào)mTOR 的表達，且mTOR siRNA 還能抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞的增殖，這種作用還具有時間和濃度依賴性。目前，雷帕霉素雖沒有在臨床上用于喉鱗狀細胞癌的治療，但一系列的研究結(jié)果提示，隨著對mTOR 通路的研究深入，雷帕霉素及同類藥物可能成為喉鱗狀細胞癌靶向治療的新思路。

綜上所述，本研究利用RNA 干擾技術(shù)進一步明確了mTOR 在喉鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，初步探討了利用mTOR 抑制劑靶向治療喉鱗狀細胞癌的價值，這為喉鱗狀細胞癌的分子治療提供了一定的理論依據(jù)。

［1］Mahalingam D，Sankhala K，Mita A，et al. Targeting the mTOR pathway using deforolimus in cancer therapy［J］. Future Oncol，2009，5(3):291 -303.

［2］Garrido-Laguna I，Tan AC，Uson M，et al.Integrated preclinical and clinical development of mTOR inhibitors in pancreatic cancer［J］.Br J Cancer，2010，103(5):649 -655.

［3］Nagata Y，Takahashi A，Ohnishi K，et al. Effect of rapamycin，an mTOR inhibitor，on radiation sensitivity of lung cancer cells having different p53 gene status［J］. Int J Oncol，2010，37(4):1001-1010.

［4］Stephan S，Datta K，Wang E，et al.Effect of rapamycin alone and in combination with antiangiogenesis therapy in an orthotopic model of human pancreatic cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(20):6993 -7000.

［5］Fingar DC，Richardson CJ，Tee AR，et al.mTOR controls cell cycle progression through its cell growth effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic translation initiation factor 4E［J］.Mol Cell Biol，2004，24(1):200 -216.

［6］董兵，朱毅敏.癌癥分子靶向治療的研究現(xiàn)狀［J］. 癌癥，2010，29(3):370 -375.

［7］董婉維，孫開來，鄭志紅. RNA 干擾技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2009，9(6):1174 -1177.

［8］朱明智，谷元廷.乳腺癌分子靶向治療研究新進展［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2011，24(2):172 -174.

［9］Wenner CE. Cell signaling and cancer-possible targets for therapy［J］.J Cell Physiol，2010，223(2):299 -308.

［10］Huang S，Houghton PJ.Targeting mTOR signaling for cancer therapy［J］.Curr Opin Pharmacol，2003，3(4):371 -377.

［11］Voss MH，Molina AM，Motzer RJ.mTOR inhibitors in advanced renal cell carcinoma［J］. Hematol Oncol Clin North Am，2011，25(4):835 -852.