張玉林，董曉丹

（上海環(huán)境衛(wèi)生工程設(shè)計(jì)院，上海 200232）

分光光度法測(cè)定垃圾堆肥中蛋白質(zhì)的不確定度評(píng)定

張玉林，董曉丹

（上海環(huán)境衛(wèi)生工程設(shè)計(jì)院，上海 200232）

根據(jù)GB 5009．5—2010中分光光度法對(duì)垃圾堆肥中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，分析其在測(cè)定過程中的不確定度來源，并對(duì)測(cè)試結(jié)果做不確定評(píng)定。

分光光度法；垃圾堆肥；蛋白質(zhì)；不確定度

國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中指出檢測(cè)結(jié)果的完整報(bào)告應(yīng)包含測(cè)量不確定度，定量說明結(jié)果的質(zhì)量［1］。在《計(jì)量學(xué)基礎(chǔ)及通用術(shù)語的國際詞匯》中測(cè)量不確定度定義為一個(gè)與測(cè)量結(jié)果有關(guān)的參數(shù)，它表征帶測(cè)量數(shù)值的不確定度信息［2］。由于垃圾的不確定性較大，分析過程較復(fù)雜，為得到堆肥中蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確含量，確保堆肥產(chǎn)品運(yùn)用到實(shí)踐生產(chǎn)中的有效性，必須對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行不確定度的評(píng)價(jià)，確定置信區(qū)間，以保證所測(cè)數(shù)據(jù)的可信度。

1 測(cè)定方法

依據(jù)GB 5009．5—2010中分光光度法，取適量均勻固體試樣0．5 g左右（精確到0．001 g），移入100 mL定氮瓶中，加入0．1 g硫酸銅、1 g硫酸鉀及5 mL硫酸。輕搖后于瓶口放1個(gè)小漏斗。將定氮瓶放在電爐上小心加熱至瓶中液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后取下冷卻，然后小心移入100 mL容量瓶中定容。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

用0．100 0 g/L氨氮標(biāo)液作為使用液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別吸取 0．00、0．05、0．10、0．20、0．40、0．60、0．80、1．00 mL 置于 10 mL 比色管中，加入4．0 mL乙酸鈉乙酸緩沖溶液及4．0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴鍋中加熱15 min。取出冷卻至室溫。以零管為參比，1 cm比色皿，于400 nm波長處測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

試樣測(cè)定：精密吸取2 mL試樣溶液和同等空白溶液，分別于10 mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色過程操作，測(cè)得吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程求出含量。

2 數(shù)學(xué)模型建立

以下為試樣中蛋白質(zhì)的含量計(jì)算公式，即為該測(cè)試方法的數(shù)學(xué)模型。

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量（g/100 g）；c為試樣測(cè)定液中氮的含量（μg）；c0為試劑空白測(cè)定液中氮的含量（μg）；V1為試樣消化液定容體積（mL），100 mL；V2為制備試樣溶液的消化液體積（mL），5 mL硫酸；V3為試樣溶液總體積（mL），10 mL；V4為測(cè)定用吸取試樣溶液體積（mL）；m為試樣質(zhì)量（g）；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般取值為6．25。

3 不確定度來源分析

試樣中蛋白質(zhì)含量的不確定度來源主要有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度U（c標(biāo)）、氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線建立引入的不確定度U（c曲）、曲線擬合和引用的不確定度U（cm）、未知樣品稱量引起的不確定度U（m）、未知樣品濃度c測(cè)試過程產(chǎn)生的不確定度U（c未）、重復(fù)性測(cè)試產(chǎn)生的不確定度U（A）、數(shù)據(jù)修約引入的不確定度U（c修）。

4 不確定度計(jì)算

4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度U（c標(biāo)）

采用國家環(huán)?？偩值臉?biāo)樣1．000 g/L，不確定度區(qū)間半寬為0．3%，屬于正態(tài)分布，95%置信概率下，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線建立引入的不確定度U（c曲）

4.2.1 氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置引入的不確定度U（V?。?/p>

氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1．000 g/L，氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液0．1 g/L，使用A級(jí)10．00 mL單標(biāo)線移液管，A級(jí)100 mL容量瓶量取液體體積時(shí)引入的不確定度采用B類方法評(píng)定。從JJG 196—2006常規(guī)玻璃量器檢定規(guī)程中查出，A級(jí)10．00 mL單標(biāo)線移液管的誤差為±0．02 mL，A級(jí)100 mL容量瓶誤差為±0．10 mL，A級(jí)1 mL流出式分度吸量管誤差為±0．008 mL。不同體積的玻璃儀器引入的不確定度見表1。

計(jì)算出A級(jí)10．00 mL單標(biāo)線移液管、A級(jí)100 mL容量瓶、A級(jí)1 mL流出式分度吸量管不確定度合成，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線建立過程儀器相對(duì)不確定度：

4.2.2 10 mL比色管引入的不確定度U（V10比）

樣品移入比色管中定容，所用的比色管為10 mL±0．025 mL比色管，按均勻分布，取K=，則示值允許誤差引入的不確定度為：U（V1）0=0．025/=0．014 4 （mL）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)的室溫為（20±2）℃，水的體積膨脹系數(shù)為2．1×10-4℃-1，由溫度變化導(dǎo)致的定容體積變化，按均勻分布，取K=，得出溫度變化導(dǎo)致定容體積變化引入的不確定度為：U（V）t=2×10×2．1×10-4/=0．002 4 （mL）。

合成以上2個(gè)分量得到標(biāo)準(zhǔn)溶液系列最高濃度點(diǎn)定容過程引入的不確定度和相對(duì)不確定度分別

合成以上2個(gè)分量得到標(biāo)準(zhǔn)溶液系列平均濃度點(diǎn)定容過程引入的相對(duì)不確定度為：

4.3 曲線擬合和引用的不確定度U（cm）

工作曲線共有7個(gè)不同濃度點(diǎn)并測(cè)定1個(gè)空白點(diǎn)，氨氮每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)讀數(shù)2次，加入量和吸光度分別見表2。

表2 工作校準(zhǔn)曲線上各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的濃度及吸光度

空白測(cè)定值0．054 0。校準(zhǔn)吸光度為0．000 0、0．035 0、0．073 7、0．135 5、0．270 4、0．409 1、0．546 5、0．681 8。設(shè)定數(shù)學(xué)模型計(jì)算出的校準(zhǔn)曲線回歸方程斜率為0．006 8，回歸方程的截距為 0．001 1，回歸系數(shù) 0．999 9。

y=bx+a=0．006 8x+0．001 1。

依據(jù)貝塞爾公式對(duì)工作曲線繪制過程產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行計(jì)算，其中實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度（曲線上每個(gè)濃度測(cè)量2次共7個(gè)點(diǎn)，n=2×7=14，待測(cè)樣品測(cè)量次數(shù)p=2，未知樣品校準(zhǔn)吸光度為0．291 4、0．291 8，平均值為0．291 6，未知樣品測(cè)出吸光度后回歸算出濃度為cm=42．72 μg，工作曲線標(biāo)樣含量平均值為 45．00 μg。

表1 玻璃儀器引入的不確定度

式中：S為校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；P為樣品溶液的測(cè)定次數(shù)，p=2；n為校準(zhǔn)溶液（含空白溶液）的測(cè)定總次數(shù)，n=14；b為校準(zhǔn)曲線的斜率，其值為0．006 8；a為校準(zhǔn)曲線的截距，其值為0．001 1；m為由校準(zhǔn)曲線方程求得的樣品溶液中蛋白質(zhì)含量，μg；為不同校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液中蛋白質(zhì)濃度的平均值，μg；xi為不同校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)的配置值，μg；xj為針對(duì)每一次不同標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)測(cè)的吸收值由校準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定值，μg；yi為單次標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的測(cè)定值。

則工作曲線變動(dòng)的質(zhì)量濃度c的相對(duì)不確定度為：

4.4 未知樣品稱量引起的不確定度U（m）

4.4.1 天平分辨力引入的不確定度U（1m）

根據(jù)證書可知所用天平的分辨力為0．000 1 g，屬于均勻分布，則U（1m）=0．29×0．000 1=0．000 029 （g）。

4.4.2 稱量的變動(dòng)性引入的不確定度U（2m）

樣品質(zhì)量為m=0．523 3 g，準(zhǔn)確至最大允差±0．000 2 g，K=，均勻分布，相對(duì)不確定度為：U（2m）=0．000 2=0．000 115 （g）。

4.5 未知樣品濃度測(cè)試過程產(chǎn)生的不確定度U（c未）

4.5.1 消解液定容所用容量瓶的不確定度U（V1）

4.5.2 制備試樣溶液的消化液體積U（V2）

5 mL單標(biāo)線移液管引入的不確定度來源有2個(gè)方面：①體積定值的準(zhǔn)確性引入的不確定度，按制造商給定的容量允差為±0．015 mL，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0．015/＝0．008 7（mL），==0．001 7；②由于校正和

使用時(shí)的溫度不同所引起的體積不確定度，可視為相差2℃，水的膨脹系數(shù)為2．1×10-4℃-1，轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.5.3 試樣溶液總體積引入的不確定度U（V3）

樣品移入10 mL比色管中定容，所用的比色管為（10±0．025）mL比色管，按均勻分布，取K=，則示值允許誤差引入的不確定度為：U（V10）=0．025/=0．014 4 （mL）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)的室溫為（20±2） ℃，水的體積膨脹系數(shù)為2．1×10-4℃-1，由溫度變化導(dǎo)致的定容體積變化，按均勻分布，取K=，得出溫度變化導(dǎo)致定容體積變化引入的不確定度為：U（V）t=2×10×2．1×10-4/=0．002 4（mL）。

4.5.4 移取消化液體積不確定度U（V4）

取樣使用A級(jí)2．00 mL單標(biāo)線吸量管，引入不確定度中只考慮移液管體積和實(shí)際操作溫度變化2℃帶來的不確定度。因?yàn)锳級(jí)2．00 mL單標(biāo)線移液管充滿液體至滿刻度的變動(dòng)性，包含在樣品重復(fù)性測(cè)試中，故不需要考慮。取樣過程合成相對(duì)不確定度為：

4.5.5 樣品消解過程中產(chǎn)生的測(cè)量不確定度U（V消）

合成以上幾個(gè)分量得到標(biāo)準(zhǔn)溶液系列平均濃度點(diǎn)定容過程引入的相對(duì)不確定度為：

4.6 重復(fù)性測(cè)試產(chǎn)生的不確定度U（A）

按工作曲線相同操作步驟，分別吸取2 mL消解液與10．0 mL比色管中，對(duì)垃圾堆肥進(jìn)行6次重復(fù)性測(cè)量分析，數(shù)據(jù)見表2。

表2 樣品重復(fù)性測(cè)量數(shù)據(jù)

測(cè)量時(shí)所用數(shù)據(jù)為樣品平行測(cè)定與重復(fù)性測(cè)量的數(shù)據(jù)，因此不需要評(píng)定每次進(jìn)行儀器讀數(shù)變化引起的不確定度［3］。由表2數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，樣品濃度最高 45．79 μg，最低 42．72 μg，可以用 A類不確定度評(píng)定的極差法進(jìn)行不確定度計(jì)算，查c與n的對(duì)應(yīng)關(guān)系得：

日常檢測(cè)試樣1次數(shù)據(jù)，根據(jù)表2中序號(hào)1的數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式測(cè)得水樣濃度值為42．72 μg。樣品重復(fù)性測(cè)試產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

4.7 數(shù)據(jù)修約引入的不確定度U（c修）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)給出的有效位數(shù)，修約間隔為修約值的最小單元0．01%，數(shù)據(jù)修約的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品濃度為6．31 g/100g，其相對(duì)不確定度為：

5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（Cc）及擴(kuò)展不確定度U

由公式（1） ～（7） 合并各組相對(duì)不確定度可得：

未知樣品濃度X=6．31 g/100 g，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

取包含因子k=2置信概率近95%，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U=kU（Cc）=2×0．976 8（g/100 g）=1．95（g/100 g）。

6 結(jié)論

1）用比色法測(cè)定堆肥中蛋白質(zhì)含量，取包含因子k=2時(shí)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)大于等于1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留3位小數(shù)，所以最后結(jié)果表示為（6．31±1．95） g/100 g。

2）通過計(jì)算過程，比較各不確定度分量的權(quán)重，可知本方法影響不確定度的因素中，工作曲線擬合、未知樣品濃度測(cè)試過程產(chǎn)生的不確定度和樣品重復(fù)性測(cè)量及標(biāo)準(zhǔn)樣品引入的不確定度為主要不確定度分量。

3）為了降低不確定度，可以通過提高操作人員的業(yè)務(wù)水平，適當(dāng)增加樣品重復(fù)測(cè)試次數(shù)，多次繪制工作曲線等方法，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

［1］JJF 1059—1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］．北京：中國計(jì)量出版社，1999．

［2］張淑芹．測(cè)量不確定度的評(píng)定方法［J］．品牌與標(biāo)準(zhǔn)化，2010（4）：40-41．

［3］楊振宇．元素相對(duì)測(cè)定不確定度的評(píng)定［J］．理化檢驗(yàn)，2005（5）：36-40．

Uncertainty of Proteins Test in Waste Composting by Spectrophotometry

Zhang Yulin，Dong Xiaodan
（Shanghai Environmental Sanitary Engineering Design Institute,Shanghai 200232）

According to the provisions of spectrophotometry in GB/T 5009．5—2010,the content of protein in waste composting was tested．In the determination process,the sources of its uncertainty were analyzed,and the uncertainty of the results was evaluated．

spectrophotometry；waste composting；protein；uncertainty

X833

A

1005-8206（2012）05-0049-04

2012-05-21

張玉林（1982—），主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)、化學(xué)分析、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制工作。

（責(zé)任編輯：鄭雯）