王瑋煒 黃安斌 杜 戎 劉宇宏 宋 優(yōu) 沈凌汛 余立凱

可誘導(dǎo)共刺激分子在BXSB狼瘡小鼠腎臟中的表達(dá)

王瑋煒 黃安斌 杜 戎 劉宇宏 宋 優(yōu) 沈凌汛 余立凱＊

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢430022）

目的 觀察可誘導(dǎo)共刺激分子（ICOS）在BXSB狼瘡小鼠腎臟中的表達(dá)，探討ICOS在狼瘡腎炎發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。方法 選取8周齡及16周齡雄性BXSB小鼠各6只，并以8周齡C57BL／6雄性小鼠6只為正常對(duì)照，用免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)ICOS在小鼠腎臟中的表達(dá)水平。結(jié)果 正常對(duì)照組C57BL／6小鼠腎組織ICOS染色少許腎小管細(xì)胞呈淺棕色；8周齡及16周齡BXSB小鼠腎臟組織ICOS強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞呈深棕色著色，分布于腎小管。8、16周齡BXSB組小鼠腎組織內(nèi)ICOS mRNA表達(dá)水平［（6.43±0.92），（9.48±1.30）］均較正常對(duì)照組（4.58±0.63）增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；16周齡BXSB組小鼠的ICOS mRNA表達(dá)水平較8周齡BXSB組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 腎組織ICOS的分布及表達(dá)增加可能是BXSB小鼠狼瘡腎炎發(fā)病的重要機(jī)制之一。

可誘導(dǎo)共刺激分子；狼瘡腎炎；免疫組織化學(xué)；BXSB小鼠

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性自身免疫疾病。它可累及各個(gè)系統(tǒng)和器官，但以腎為最常見。臨床上有狼瘡腎炎（l upus nephritis，LN）表現(xiàn)者，占45-85%。腎衰竭是SLE死亡的常見原因［1］。LN的發(fā)病機(jī)制不明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為易感者免疫耐受性減弱，T細(xì)胞功能缺陷是SLE整個(gè)免疫系統(tǒng)紊亂的核心?？乖禺愋訲細(xì)胞的活化需要兩個(gè)不同的信號(hào)，第一信號(hào)來(lái)自抗原肽-MHC分子組成的復(fù)合物與T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的相互作用；第二信號(hào)由抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）表面表達(dá)的共刺激分子（costi mulator）傳遞給T細(xì)胞，該信號(hào)確保免疫應(yīng)答在需要的條件下才能發(fā)生?？烧T 導(dǎo) 共 刺 激 因 子 （inducible co-sti mulator f actor，ICOS）屬于CD28／B7家族，是新近發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于活化T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的共刺激分子。ICOS優(yōu)勢(shì)表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，可以促進(jìn)活化T細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞因子的分泌、調(diào)節(jié)Thl／Th2的極化、促進(jìn)T細(xì)胞依賴的抗體產(chǎn)生［2］。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡這類自身免疫性疾病中，一些參與T細(xì)胞活化和功能的共刺激因子與疾病活動(dòng)的關(guān)系一直是業(yè)內(nèi)關(guān)注的熱點(diǎn)，并且ICOS可能成為自身免疫性疾病調(diào)控治療的理想靶點(diǎn)［3］。本文以經(jīng)典的BXSB狼瘡小鼠腎臟為研究對(duì)象，用免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)PCR方法，探索ICOS在狼瘡腎損害的作用機(jī)制。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

BXSB雄性小鼠是由美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系提供。正常對(duì)照選取與BXSB小鼠同基因（syngeneie）的 C57BL／6（H-2b）小鼠，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院遺傳學(xué)研究所。在同濟(jì)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物中心，給予水和裸鼠飼料飼養(yǎng)。分別取8周齡正常C57BL／6雄性小鼠6只，以及8、16周不同周齡BXSB雄性小鼠各6只，共18只用于本實(shí)驗(yàn)。

2.主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)主要試劑包括ICOS抗體（eBioscience，Catalog No.14-9942-81），ICOS抗體之二抗（GT ANTI-RAT，Ig G（H＋L）MSA KPL）（BIOT，Catalog No.16-16-12），SYBR Greener q PCR Master Mix（Invitr ogen公司），RNA提取試劑盒（Qiagen Mini RNA Easy Kit），SuperscriptTMⅢ 反轉(zhuǎn)錄 酶（Invitr ogen公司），和ABC復(fù)合物（武漢凌飛科技有限公司），q PCR引物由上海博道基因技術(shù)有限公司合成。冰凍切片機(jī)為德國(guó)Leica Micr osyste ms公司產(chǎn)品（型號(hào)CM1900），PCR儀為美國(guó) MJ Research公 司 產(chǎn) 品 （型 號(hào) PTC-200 Peltier Ther mal Cycler），實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀為美國(guó)Applied Biosyste m公司產(chǎn)品（型號(hào)PRISM 7500），顯微鏡（型號(hào)BX51）及數(shù)碼相機(jī)（型號(hào)DXM1200配Nikon ACT-1軟件）為日本Ol y mpus和Nikon公司產(chǎn)品。

3.免疫組織化學(xué)技術(shù)

小鼠斷頸處死，立即取腎并在4%多聚甲醛液固定48 h，然后30%蔗糖-PBS浸泡24 h。冰凍切片（厚20μm）浸入含0.3%Triton X100的0.01 mol／L PBS破膜15 min，再用3%牛血清白蛋白于室溫下封閉1 h。傾去封閉液，加入1∶1000稀釋的一抗（ICOS抗體）于4℃孵育48 h，然后0.01 mol／L PBS漂洗3次。組織切片再滴加1∶1000稀釋的二抗約30μl，室溫孵育2 h，0.01 mol／L PBS漂洗3次。之后組織切片滴加ABC復(fù)合物30μl于室溫孵育2 h，0.01 mol／L PBS漂洗3次。組織切片滴加DAB顯色液30μl，顯色15-20 min后用0.01 mol／L PBS漂洗3次。組織切片經(jīng)脫水、透明及封片后，于光鏡下觀察，對(duì)細(xì)胞染色反應(yīng)采用目測(cè)半定量法，即深棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性，棕黃色為陽(yáng)性，淺棕黃色為弱陽(yáng)性，未染色為陰性。在封閉同時(shí)或者封閉之后用過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，沒有經(jīng)過蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照組為不加一抗染色。

4.腎組織總RNA提取及c DNA合成

分別取8周齡正常C57BL／6雄性小鼠以及8、16周不同周齡BXSB雄性小鼠各6只，提取腎組織總RNA（total RNA）及c DNA的合成：本研究選用德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒（Qiagen Mini RNA Easy Kit）。經(jīng)提取純化的總 RNA 先被反轉(zhuǎn)錄成為c DNA，這一步選用美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的SuperscriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)組成如下：1μg的 RNA （容積約為3-5μl），10μl的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（2×），2μl的Superscript反轉(zhuǎn)錄酶混合液，加水至20μl。反應(yīng)在25℃10 min，50℃30 min，85℃5 min后在冰上冷卻，再加入1μl E.coli RNase H酶，繼續(xù)在37℃反應(yīng)20 min。然后，把反轉(zhuǎn)錄的c DNA稀釋為5ng／μl用于q PCR反應(yīng)或者儲(chǔ)藏于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。

5.定量實(shí)時(shí)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（q PCR）

待擴(kuò)增的ICOS分子基因和1個(gè)內(nèi)參照基因3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物全部用PRI MER3在線軟件設(shè)計(jì)（http：／／frodo.wi.mit.edu／）。引物信息：ICOS前向引物GTGCAGCTTTCGTTGTGGTA，逆向引物TTAGGGTCATGCACACTGGA，Gen Bank＃ NM＿017480，GAPDH 前向引物GGCATTGCTCTCAATGACAA，逆向引物 ATGTAGGCCATGAGGTCCAC，Gen Bank＃ NM＿008084。待測(cè)基因序列自下列網(wǎng)站獲?。篽ttp：／／www.geno me.ucsc.edu。待測(cè)基因ICOS和參照基因GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物均跨過兩個(gè)外顯子從而達(dá)到特異性地只擴(kuò)增從mRNA反轉(zhuǎn)錄來(lái)的c DNA，但不會(huì)擴(kuò)增任何來(lái)源的基因組DNA。反應(yīng)組成如下：20ng的c DNA（4μl），10μM 的前向和逆向引物各0.2μl，2×濃縮反應(yīng)液5μl（SYBR Greener q PCR Master Mix，Invitr ogen公司），加水至10μl。所有待測(cè)樣品均設(shè)定3個(gè)重復(fù)反應(yīng)，以求高精度的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用Applied Biosystem Inc公司的PRISM 7500型q PCR反應(yīng)儀，反應(yīng)程序如下：50℃2 min，95℃10 min之后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)：95℃15s，55℃30s，70℃30s。反應(yīng)結(jié)束后，從機(jī)器程序中輸出每個(gè)反應(yīng)的臨界循環(huán)數(shù)，即CT值，用于后續(xù)計(jì)算。

6.基因表達(dá)水平的測(cè)定

首先需要為每個(gè)基因的反應(yīng)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。本實(shí)驗(yàn)從每個(gè)高質(zhì)量的待測(cè)樣品c DNA溶液中各抽取等分量，然后合并成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，并且準(zhǔn)確測(cè)定這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的c DNA濃度。根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，制備一個(gè)系列的稀釋樣品：100、50、20、10、5、2、1ng／μl。用這7個(gè)稀釋度的樣品分別為2個(gè)基因構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)基因在待測(cè)樣品中的相對(duì)表達(dá)水平。最后，以正常小鼠的表達(dá)水平為基線，其它各組均被正常鼠的表達(dá)值校正。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，兩組間用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P≤0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

結(jié) 果

1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

正常組小鼠腎組織染色結(jié)果：少許ICOS陽(yáng)性細(xì)胞位于腎小管，呈淺棕色著色；（圖1 A）；

8周齡BXSB小鼠腎組織染色結(jié)果：ICOS強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞呈深棕色著色，位于腎小管，較平均分布（圖1B）；

16周齡BXSB小鼠腎組織染色結(jié)果：ICOS強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞呈深棕色著色，位于腎小管，較平均分布（圖1C）。

圖1 小鼠腎ICOS免疫組織化學(xué)染色：（A.正常對(duì)照組；B.8周齡BXSB小鼠；C.16周齡BXSB小鼠；）標(biāo)尺＝100μmFig.1 Immunohistochemical staining of ICOS in the kidney of 16-week BXSB mice（A.control mice，B.8-week BXSB mice，C.16-week BXSB mice），Bar＝100μm

2.實(shí)時(shí)PCR定量結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)化后的腎組織ICOS mRNA表達(dá)水平在正常組鼠為4.58±0.63；8周齡BXSB小鼠為6.43±0.92；16周齡BXSB小鼠為9.48±1.30。兩組間經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示8周齡和16周齡BXSB小鼠均顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；同時(shí)16周齡BXSB小鼠亦顯著高于8周齡BXSB小鼠（P＜0.05）（圖2）。

圖2 BXSB雄性小鼠腎ICOS mRNA表達(dá)水平Fig.2 mRNA expression level of ICOS in the kidney of BXSB male mice

討 論

1999年德國(guó)學(xué)者Hutloff等在人外周血活化T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了一種新的共刺激分子，命名為ICOS（inducible T-cell co-sti mulator，inducible co-sti mulator）［4］。ICOS為I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。ICOS優(yōu)勢(shì)表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面，表明ICOS對(duì)活化的T細(xì)胞的調(diào)節(jié)更為重要，但在受到炎性刺激時(shí)也可以表達(dá)于肺、腎、骨骼肌等非淋巴組織上［5］。鑒于活化的T細(xì)胞表達(dá)ICOS，而且ICOS及其配體途徑調(diào)控T細(xì)胞應(yīng)答的效應(yīng)階段，ICOS在自身免疫病中的作用受到廣泛重視。對(duì)重癥肌無(wú)力、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性肌病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的研究均證實(shí)ICOS及其配體途徑與自身免疫病的發(fā)病存在密切關(guān)系［6、7］。

BXSB狼瘡鼠為重組近交系小鼠，能自發(fā)地出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、T細(xì)胞功能障礙、多克隆B細(xì)胞過度活化、多種自身抗體的產(chǎn)生等表現(xiàn)，臨床和病理表現(xiàn)與人類SLE極其相似，尤其是雄性BXSB小鼠，由于Y染色體上帶有Yaa基因使其發(fā)病早且嚴(yán)重，一般從8周齡開始即發(fā)病，故常被作為SLE的小鼠動(dòng)物模型，廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究中［8］。本研究用免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)定量PCR方法，探索ICOS在BXSB小鼠LN中的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示：正常組鼠腎組織ICOS免疫組織化學(xué)染色結(jié)果未見明顯染色，但是實(shí)時(shí)PCR定量檢測(cè)其仍有ICOS表達(dá)。不同周齡BXSB小鼠腎組織均有ICOS陽(yáng)性染色，陽(yáng)性細(xì)胞位于腎小管，而PCR定量檢測(cè)亦顯示ICOS表達(dá)較正常組鼠腎組織有明顯增加。我們的研究結(jié)果提示ICOS在BXSB小鼠腎臟有隨周齡表達(dá)增加的趨勢(shì)。筆者推測(cè)ICOS表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞可能與腎小管在一定程度上參與抗原呈遞有關(guān)，提示BXSB小鼠腎損害的發(fā)病、疾病的活動(dòng)可能與腎內(nèi)ICOS分布與表達(dá)的的共刺激信號(hào)強(qiáng)度增加有關(guān)。

關(guān)于ICOS與LN的關(guān)系尚少見文獻(xiàn)報(bào)道。Iwai H［9］在SLE動(dòng)物模型 NZB／NZW Fl代雌性小鼠中檢測(cè)到脾臟和外周血T淋巴細(xì)胞膜表面ICOS表增高。Patschan S［10］基于對(duì)28例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的臨床研究，認(rèn)為CD4＋T細(xì)胞上ICOS的表達(dá)與狼瘡腎損害和疾病活動(dòng)度密切相關(guān)。以上研究均未涉及ICOS在BXSB小鼠腎內(nèi)分布的可能影響。進(jìn)一步探討ICOS及其配體通路在LN中的精確作用，研究多種共刺激分子間如何協(xié)同調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，對(duì)明確LN的發(fā)病機(jī)制，尋求新的治療方法，有著重要的意義。

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Expression of Inducible Costi mulator in Kidney of BXSB Mice

Wang Wei wei，Huang Anbin，Du Rong，Liu Yuhong，Song You，Shen Lingxun，Yu Likai＊
（Depart ment of Rheu matology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China）

Objective By anal ysis of t he expression of inducible costi mulator（ICOS）in t he kidney of BXSB mice，this study was trying to clarify the potential role of ICOS in the pathogenesis of lupus nephritis in BXSB mice.Met hods ICOS was detected in contr ol mice，8-week and 16-week BXSB male mice by using i mmunohistoche mistry and real-ti me PCR.Results ICOS i mmunostaining in contr ol mice was light brown and distributed in few renal tubules；but in 8-and 16-week BXSB mice，the ICOS i mmunostaining was much str onger as dar k br own t han that in contr ol mice.The mRNA expression of ICOS was significantly increased in renal tissues fro m 8-and 16-week BXSB mice as co mpared with that in the control mice（6.43±0.92 and 9.48±1.30 vs 4.58±0.63，P＜0.01），and f urt her more，t here was significantl y difference in ICOS mRNA expression bet ween 8-and 16-week BXSB mice（P＜0.05）.Concl usion Distribution and up regulation of ICOS may constitute a mechanis m that was involved in the pathogenesis of lupus nephritis in BXSB mice.

Inducible costi mulator；Lupus nephritis；I mmunohistochemistry；BXSB mouse

R334＋.1

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.012

2012-02-20

2012-05-25

王瑋煒，女（1982年），漢族，博士研究生。

＊通訊作者（To who m correspondence should be addressed）