李春艷，劉建寧，高洪文

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原030032；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

肌醇-1-磷酸合成酶（MIPS）調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)肌醇的含量，肌醇作為一種重要的滲透保護(hù)物質(zhì)不僅是植物細(xì)胞中磷元素的主要貯存形式，而且在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、保護(hù)植物免受外部逆境傷害、激素貯存與運(yùn)輸、細(xì)胞壁生物合成等方面都起到十分重要的作用［1］。Munnikt等［2］在1998年的研究中表明肌醇是植物第二信使分子IP3（1，4，5-三磷酸肌醇）的前體物質(zhì)，IP3通過與位于液泡膜和粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2＋通道結(jié)合，使Ca2＋激活鈣調(diào)蛋白，形成Ca2＋／Ca M 復(fù)合物，該復(fù)合物通過激活一系列下游蛋白，從而調(diào)控生理代謝及基因表達(dá)，并由此引發(fā)與抗脅迫相關(guān)的一系列級聯(lián)反應(yīng)。對MIPS蛋白表達(dá)的調(diào)控將會影響到肌醇及其復(fù)合產(chǎn)物的表達(dá)調(diào)控。本研究對東方山羊豆Go MIPS基因cDNA全長編碼區(qū)進(jìn)行了分子克隆，構(gòu)建了東方山羊豆（Galega.orientalis L.）Go MIPS基因pCAMBIA1302雙元表達(dá)載體（含有綠色熒光蛋白GFP），為研究Go MIPS基因亞細(xì)胞定位及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對Go MIPS基因編碼蛋白的生物學(xué)功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株

大腸桿菌感受態(tài)DH5α購自天根生化科技有限公司，p MD19-Tvector購自Ta KaRa公司，pCAMBIA1302載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所友情饋贈。

1.2 酶及試劑

限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶和DNaseI酶及DNA純化回收試劑盒均購自Ta KaRa公司，cDNA Synthesis Kit為Promega公司產(chǎn)品，Trizol和引物均購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方 法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已克隆出的東方山羊豆Go MIPS基因序列，應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)一對在目的基因兩側(cè)帶有NcoI／SpeI酶切位點(diǎn)的引物P1和P2，上游引物是加有NcoI酶切位點(diǎn)（CCATGG），下游引物是去掉終止子TGA后加有SpeI酶切位點(diǎn)（ACTAGT）的引物。

1.3.2 RNA的提取 取培養(yǎng)的東方山羊豆的幼嫩葉片，采用Trizol法提取制備總RNA，提取后采用DNase I去除痕量DNA，方法依照說明書進(jìn)行。

1.3.3 RT-PCR擴(kuò)增Go MIPS基因 將所提取的組織總RNA按照cDNA Synthesis Kit使用說明書進(jìn)行RT（反轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成cDNA第一鏈，再以c DNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

PCR循環(huán)反應(yīng)條件是：98℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定和測序 回收的PCR產(chǎn)物與p MD19-Tvector連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆搖菌過夜，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定，選正確的陽性菌落植菌，提取質(zhì)粒p MD-MIPS，送Invitrogen公司測序鑒定。

1.3.5 表達(dá)載體構(gòu)建 將中間載體p MD-MIPS和p CAMBIA1302空載體進(jìn)行NcoI／SpeI雙酶切，37℃16 h，經(jīng)凝膠電泳檢測，利用凝膠電泳DNA回收試劑盒分別回收目的片段。在T4連接酶的作用下，將回收的目的片段連接，連接體系為10μL，37℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性菌落植菌，提取陽性克隆質(zhì)粒pCAMBIA1302-MIPS。

1.3.6 雙酶切鑒定 對p CAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒進(jìn)行NcoI／SpeI雙酶切鑒定，取10μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.7 序列測定與分析 將重組載體pCAMBIA1302-MIPS送Invitrogen公司測序，以p CAM-BIA1302載體通用引物雙向序列測定，測定結(jié)果通過GenBank檢索分析，并驗(yàn)證其閱讀框架。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測

總RNA的凝膠電泳結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在凝膠上顯示出兩條清晰的條帶，分別是28 s和18 s，結(jié)果表明試驗(yàn)所提取的總RNA較完整。經(jīng)核酸／蛋白質(zhì)濃度測定儀測定，所提取的總RNA的OD260／OD280比值在1.8～2.0之間，表明總RNA純度較高。

2.2 Go MIPS基因RT-PCR擴(kuò)增

取5μL Go MIPS基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示RT-PCR產(chǎn)物約1 500 bp左右的特異性擴(kuò)增片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 Go MIPS重組表達(dá)載體的構(gòu)建

東方山羊豆Go MIPS基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建見圖3所示。

圖1 總RNA的凝膠電泳M.DNA Marker DL 2 000；1.總 RNAFig.1 Eectrophoresis of total RNAM.DNA Marker DL 2 000；1.Total RNA

圖2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖M.DNA Marker DL 2 000；1.RT-PCR產(chǎn)物Fig.2 Gel ectrophoresis of RT-PCR productM.DNA Marker DL 2 000；1.RT-PCR Product

圖3 重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.3 Procedure of construction of the recombinant expression vector

2.4 雙酶切鑒定

提取p MD-MIPS質(zhì)粒，用NcoI／SpeI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳得到了一條1 500 bp左右的條帶，與目的片段的大小相符，提取pCAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒，同樣用NcoI／SpeI雙酶切，也在約1 500 bp處獲得了一條特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖4），測序后也無堿基突變，表明p CAMBIA1302-MIPS增強(qiáng)型表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pCAMBIA1302-MIPS和pCAMBIA1302空質(zhì)粒、pCAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒及p MD-MIPS質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證電泳圖譜M1.λ-Hind III digest；1.pCAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒；2.pCAMBIA1302質(zhì)粒酶切；3.pCAMBIA1302-MIPS質(zhì)粒雙酶切；4.p MD-MIPS質(zhì)粒雙酶切；M2.DNA Marker DL 2 000Fig.4 Agarose gel electrophotesis analysis of reconstructed plasmidp CAMBIA1302-MIPS and the double enzymes digesting indentification of pCAMBIA1302 plasmid、pCAMBIA1302-MIPS plasmid and p MD-MIPS plasmid.M1.λ-Hind III digest；1.pCAMBIA1302-MIPS plasmid；2.the enzymes digesting indentification of pCAMBIA1302 plasmid；3.the enzymes digesting indentification of pCAMBIA1302-MIPS plasmid；4.the enzymes digesting indentification of p MD-MIPS plasmid；M2.DNA Marker DL 2 000

2.5 序列測定及分析

測定結(jié)果顯示p CAMBIA1302-MIPS重組載體中插入序列具有完整的東方山羊豆Go MIPS基因開放閱讀框去掉終止密碼子TGA的序列。在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列檢索分析，并通過NCBI的Blast比對分析，表明本試驗(yàn)利用已經(jīng)克隆的東方山羊豆Go MIPS基因序列成功的構(gòu)建了該基因的增強(qiáng)型表達(dá)載體p CAMBIA1302-MIPS。

3 討 論

肌醇-1-磷酸合成酶是肌醇代謝中的關(guān)鍵酶，也是唯一的催化6磷酸葡萄糖合成肌醇-1-磷酸的一種酶［3］，它做為一種可溶性酶已在多種單細(xì)胞和多細(xì)胞真核生物中被發(fā)現(xiàn)［4］，因此，人們普遍認(rèn)為該酶主要是限于細(xì)胞質(zhì)中。而Lackey KH等［5］在2003年的研究表明肌醇-1-磷酸合成酶在膜結(jié)合細(xì)胞器上也存在，并應(yīng)用微生物和生化分析手段檢測到該酶在豆科植物的質(zhì)膜，質(zhì)體，線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核和細(xì)胞壁中均表達(dá)。

Donahue等［6］通過對擬南芥mips1-gfp融合表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物、野生型和缺失型突變體的研究，表明植物含有多個(gè)mips基因，它編碼高度相似的酶。但它們的表達(dá)模式各不相同，mips1大多數(shù)在細(xì)胞發(fā)育階段中表達(dá)，而mips2和mips3主要局限在血管及其相關(guān)組織中，且mips1在種子發(fā)育，對鹽和脫落酸的生理反應(yīng)及抑制細(xì)胞死亡中均表現(xiàn)出重要作用，而mips2或mips3則沒有。在對喪失功能的突變體在不同生態(tài)型擬南芥mips1基因的研究中發(fā)現(xiàn)，所有的空mips1突變體有缺陷的胚胎發(fā)育，其葉脈圖案，根系生長，根帽的發(fā)展均受到抑制，且由上往下運(yùn)輸?shù)纳L素也大大減少［7］。由此可見mips1對維持肌醇含量，保持抗壞血酸，磷脂，和神經(jīng)酰胺水平及調(diào)節(jié)生長，發(fā)育和細(xì)胞死亡等方面均具有重大影響［6］。

研究發(fā)現(xiàn)，肌醇-1-磷酸合酶基因在一些植物基因組中是以基因家族的形式出現(xiàn)［6，8-9］。本試驗(yàn)前期的研究表明，以東方山羊豆幼嫩葉片為材料，在克隆MIPS基因的時(shí)候有同源性較高的序列出現(xiàn)，經(jīng)過序列比對我們選取了一條序列進(jìn)行了構(gòu)建載體等后續(xù)的研究。這說明，克隆的東方山羊豆肌醇-1-磷酸合酶基因可能也存在一個(gè)基因家族。

選擇有效的表達(dá)系統(tǒng)是進(jìn)行外源基因高效表達(dá)的重要前提。pCAMBIA1302是一種含有綠色熒光蛋白GFP可以高效表達(dá)和純化外源蛋白的載體，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)和純化。本次試驗(yàn)是在前期已經(jīng)從東方山羊豆中克隆得到了MIPS基因上進(jìn)行的，構(gòu)建了含有起始密碼子ATG和綠色熒光蛋白GFP的增強(qiáng)型雙元表達(dá)載體p CAMBIA1302-MIPS，這一結(jié)果為今后進(jìn)一步進(jìn)行亞細(xì)胞定位和構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物及對該基因編碼的蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證創(chuàng)造了必要的條件。

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