高 豐 劉思思 韓佩妍 王武龍，2鄒 瑞 王 剛 曹 陽 吳海歌王若雨 高文斌

2116622 遼寧大連，包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放療科

3116622 遼寧大連，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科4116622 遼寧大連，大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

高 豐，劉思思，韓佩妍，等.拓撲替康誘導(dǎo)肺癌細胞HTB-56凋亡早期線粒體膜電位的變化［J/CD］.中華肺部疾病雜志:電子版，2013，6(1):51-53.

目前肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤之一，近幾十年肺癌的治療尚未能獲得較大的進展，非小細胞肺癌的5年生存率仍然低于15%，大部分患者多在確診后1年內(nèi)死亡［1-3］。拓撲替康(topotecan，TPT)是半合成喜樹堿合成物，主要作用于拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，Topo-Ⅰ)，并與Topo-Ⅰ相結(jié)合，形成酶-DNA-TPT結(jié)合物，阻止腫瘤細胞DNA修復(fù)，進而導(dǎo)致腫瘤細胞雙鏈斷裂。TPT抑制肺癌細胞生長，誘導(dǎo)其凋亡可能涉及caspase-3、8、9及Fas-FasL系統(tǒng)的激活，但誘導(dǎo)其凋亡的機制尚存在爭議。我們在前期基礎(chǔ)研究上，初步明確了TPT對肺癌HTB-56細胞凋亡的影響［4-5］，本研究擬進一步觀察TPT對肺癌HTB-56細胞線粒體的影響，并探討TPT對線粒體早期功能的影響及其與細胞凋亡的關(guān)系。

材料與方法

一、實驗材料

人肺癌細胞HTB-56細胞由本教研室保存，TPT是貴州漢方制藥有限公司產(chǎn)品，JC-1為BioVision公司的產(chǎn)品，二甲基亞砜購于sigma公司DMEM購于Gibco公司。

二、實驗方法

1.細胞培養(yǎng):人肺癌細胞HTB-56培養(yǎng)于青霉素105IU/L、鏈霉素 100 mg/L，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下，含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實驗用的細胞均處于對數(shù)分裂期。

2.確定實驗用的TPT的濃度:依照前期實驗結(jié)果確定 TPT 實驗用量為 6.4 μmol/L［4-5］。

3.細胞線粒體膜電勢檢測:在TPT給藥后分別于 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h 檢測細胞線粒體跨膜電位。參照J(rèn)C-1試劑盒步驟進行實驗。流式細胞儀分析，通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變檢測線粒體膜電位的變化。檢測在流式細胞儀FACSCALIBUR上進行。JC-1的單體和聚合物熒光信號分別在FL-1和FL-2探測器上獲得。由于JC-1發(fā)射的雙波長，使用電子補償?shù)募m正綠色熒光(單體)和紅色熒光(聚合物)的重疊部分。圖分析采用CELL QUEST軟件進行，每組實驗至少進行3次，圖象顯示代表性的結(jié)果。

4.瓊脂糖凝膠電泳:細胞3×105接種，過夜貼壁，調(diào)節(jié)藥物濃度，分別TPT作用12 h、24 h、48 h和72 h，收集細胞，離心，PBS洗 2次，加入 600 μl含10 mmol·L的 Tris-HC1，加入 10 mmol/L的 EDTA和2 g/L的Triton X-100的裂解液于4℃裂解10～15 min;將裂解液收集于1.5 ml的EP管中，與等體積酚混勻，抽提1次，12 000 r/min，4℃離心10 min取550 μl上清于另一EP管中，加入等體積的1︰1酚、氯仿混合液抽提1次，再次離心。取500 μl上清，加入300 mmol/L的乙酸鈉和等體積的異丙醇，沉淀過夜。離心，70%乙醇洗滌2～3次;干燥后加入 TE(Tris10 mmol/L;EDTA 1.0 mmol/L 和0.6 g/L的Rnase A)37℃溫育30 min;樣品放在20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳1 h，溴乙啶染色后在紫外燈下觀察拍照。

結(jié) 果

一、線粒體膜電位變化

JC-1試劑盒測定結(jié)果表明，正常細胞的膜電位高，488 nm激發(fā)時發(fā)出很強的紅色熒光，而凋亡細胞線粒體的膜電位發(fā)生去極化，紅色熒光減弱，綠色熒光增強，綠/紅熒光的比值發(fā)生了變化。圖1顯示:加入TPT藥物作用4 h后可以引起細胞線粒體膜電位的下降，作用8 h后，細胞線粒體膜電位明顯下降。且該兩藥物組的綠/紅熒光比值與對照組比較，均有顯著差異(P＜0.05)。8 h組的綠/紅熒光比值與其他各藥物配比組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 TPT作用于HTB-56細胞不同時間細胞線粒體膜電位(綠光與紅光比值)的影響

二、瓊脂糖凝膠電泳

經(jīng)TPT處理48 h、72 h的HTB-56細胞出現(xiàn)明顯的DNA-Ladder，對照組及12 h、24 h組未見明顯的亮帶影，見圖2。

討 論

TPT是半合成喜樹堿合成物，其作用靶點主要在Topo-Ⅰ，通過與Topo-Ⅰ結(jié)合，形成酶-DNA-TPT穩(wěn)定結(jié)合物，阻止DNA雙鏈解螺旋的發(fā)生，抑制修復(fù)，進而導(dǎo)致雙鏈斷裂，產(chǎn)生抗腫瘤作用。TPT抗瘤譜廣，可用于結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌、進展期的宮頸癌［6-7］。

腫瘤細胞惡性生長方式與其異常增殖、分化有關(guān)，而且與細胞凋亡異常相關(guān)。細胞凋亡的途徑包括外部途徑，即通過細胞外死亡受體激活細胞內(nèi)的凋亡酶半胱氨酸特異性蛋白酶(caspase-8)，和內(nèi)部途徑，即通過改變線粒體外膜通透性(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)使多種促細胞凋亡因子從線粒體內(nèi)外膜間隙(intermembrane space，IMS)釋放到胞質(zhì)，從而激活Caspase-9，最后激活Caspase-3。這些活化的Caspase降解細胞內(nèi)的重要蛋白，引起細胞凋亡［8］。有研究認(rèn)為，即使Caspase-9受抑制，僅有MOMP改變也可能導(dǎo)致細胞死亡［9］。

我們在前期試驗中已證實了TPT對肺癌細胞HTB-56有抑制作用，其機制是誘導(dǎo)凋亡，且與caspase-3、8 有關(guān)［4-5］。線粒體與細胞凋亡關(guān)系密切，線粒體跨膜電位破壞是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，其發(fā)生在染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂等細胞核凋亡特征出現(xiàn)之前，線粒體跨膜電位崩潰，細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。本實驗中應(yīng)用JC-1檢測早期膜電位的變化，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。正常的細胞膜電位較高，而當(dāng)出現(xiàn)凋亡時，膜電位下降。本實驗中證實在4 h時該實驗方法檢測出線粒體膜電位的變化，經(jīng)過繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，72 h通過瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)明顯的凋亡。由此可見HTP-56細胞出現(xiàn)早期凋亡，且該凋亡與線粒體有關(guān)。線粒體是細胞維持生命活動的重要細胞器，在細胞存活及凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。

凋亡是一個復(fù)雜的現(xiàn)象，不同的誘因可通過相同的信號傳導(dǎo)途徑誘發(fā)細胞凋亡，并且不同的信號傳導(dǎo)途徑也不是孤立發(fā)揮作用，而是緊密聯(lián)系和相互作用的，整個信號傳導(dǎo)系統(tǒng)呈現(xiàn)復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)控結(jié)構(gòu)。隨著越來越多的研究，可以使得我們可以找到更多、更有效的治療腫瘤的切入點，并且有效拮抗凋亡抑制因子的作用，最大限度地選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，并有效地利用誘導(dǎo)凋亡來控制腫瘤。

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4 高文斌，鄭真真，高 豐，等.低劑量拓撲替康誘導(dǎo)肺癌腦轉(zhuǎn)移HTB-56/DDP細胞株凋亡機制研究［J］.中華肺部疾病雜志:電子版，2012，5(5):440-444.

5 高文斌，馬建增，鄭真真，等.拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑對小鼠Lewis肺癌細胞殺傷和誘導(dǎo)凋亡作用的研究［J］.中國實用醫(yī)刊，2011，38(12):54-55.

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