邢婭 孫路明

(同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院產(chǎn)前診斷中心，上海 200040)

產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的有效手段。現(xiàn)階段的產(chǎn)前診斷主要針對唐氏綜合征以及少數(shù)其他染色體非整倍體異常，對高齡產(chǎn)婦以及影像學(xué)技術(shù)、血清學(xué)篩查提示為高風(fēng)險的孕婦進(jìn)行有創(chuàng)的產(chǎn)前樣本取樣、細(xì)胞培養(yǎng)和染色體核型分析。早在1966年，Steele和Breg［1］就發(fā)現(xiàn)羊水細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)獲得足夠的分裂中期細(xì)胞后可以用于核型分析，從而對胎兒的染色體進(jìn)行檢測。19世紀(jì)80年代發(fā)展的絨毛膜絨毛核型分析技術(shù)使得產(chǎn)前染色體核型分析可以提前至孕早期進(jìn)行。羊水和絨毛染色體核型分析可以對胎兒染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行全面分析，作為產(chǎn)前診斷的重要手段一直沿用至今。受顯帶分辨率的限制，產(chǎn)前染色體核型分析可發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常長度都在10Mb以上，并且在進(jìn)行染色體核型分析前一般需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測結(jié)果一般在取樣2～3周后才能得到。熒光原位雜交技術(shù)(FISH)是分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)的完美組合，將特定基因組序列用熒光標(biāo)記作為探針與待檢測樣本的染色體進(jìn)行雜交，即可對染色體的數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測。產(chǎn)前FISH檢測一般只針對常見的非整倍體異常涉及到的5條染色體：13號、18號、21號以及2條性染色體。由于無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，F(xiàn)ISH檢測只需2天即可完成。但FISH的局限性在于只能定向地對一些染色體異常進(jìn)行診斷，同時，每次反應(yīng)所用的探針數(shù)目有限，無法進(jìn)行高通量的檢測。近年來發(fā)展的一些分子診斷方法如熒光定量PCR、多重探針連接擴增技術(shù)(MLPA)等也逐漸應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中［2］。但這類方法由于不能對全基因組進(jìn)行診斷，都存在一定的殘余風(fēng)險。

基因芯片技術(shù)可以在全基因組范圍進(jìn)行高分辨率掃描，不僅能檢出染色體不平衡性變異，而且能檢出亞顯微水平的拷貝數(shù)變異(CNV)，即人類基因組中DNA片段大小從1Kb到數(shù)個Mb的亞微觀結(jié)構(gòu)改變，包括基因組片段的缺失、插入、重復(fù)等［3，4］。按照探針設(shè)計原理的不同，基因芯片可以分為比較基因組雜交芯片和SNP芯片兩種。比較基因組雜交芯片是由比較基因組雜交(CGH)技術(shù)發(fā)展而來，傳統(tǒng)的CGH是用不同熒光分別標(biāo)記患者和正常對照的基因組，均勻混合后與正常人處于分裂中期的固相染色體雜交，而比較基因組雜交芯片是用Oligo基因組芯片代替中期染色體作為雜交載體［5］。SNP芯片是基于人類基因組中廣泛存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進(jìn)行探針設(shè)計，主要用于基因分型以及全基因組關(guān)聯(lián)分型，也可以用于CNV的檢測。但由于其探針設(shè)計受SNP分布的局限，不能做到全基因組覆蓋，不能在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行CNV的檢測，因此其后續(xù)產(chǎn)品中均加入了CNV探針來彌補這一不足?；蛐酒氖褂檬沟迷絹碓蕉嗟腃NV位點被發(fā)現(xiàn)，其中包括：在相同位點反復(fù)發(fā)生的具有相似臨床表型的CNV位點即病理性CNV，由此一大批微缺失/微重復(fù)綜合征被明確；在正常人類基因組廣泛存在的沒有臨床意義的良性 CNV/常見 CNV［4，6］；現(xiàn)階段對人類基因組認(rèn)識不完全而無法明確其臨床意義的新發(fā)CNV/罕見CNV。

1 基因芯片對產(chǎn)前異常的檢出

1．1 平衡性染色體結(jié)構(gòu)變異 染色體的平衡性變異，包括相互易位、倒位、插入等，由于并不涉及到遺傳物質(zhì)的缺失或增加，無法用基因芯片檢出。對于這類異常，染色體核型分析技術(shù)和中期染色體的FISH技術(shù)仍然是最佳的檢測手段，不但可以檢出這類異常，還能提示其來源，分析再發(fā)風(fēng)險并防止再次發(fā)生。平衡性染色體結(jié)構(gòu)變異在新生兒中的發(fā)生率約為0．09%［7］，其中遺傳自父母的平衡易位一般不會對胎兒造成任何表型，而新發(fā)性易位在新生兒中的發(fā)生率較低，約為0．0001%［8］，并且造成胎兒影像學(xué)異常的可能性較小。相反的，核型分析結(jié)果顯示為平衡易位的胎兒實際上可能會在易位的斷裂位點處發(fā)生微小缺失或重復(fù)，這類表面上“平衡”的異常則會在進(jìn)行基因芯片檢測時被檢出。研究數(shù)據(jù)表明這類異常有6．7%的可能會引發(fā)胎兒的異常表型［9］。另外，核型分析和比較基因組雜交芯片都無法檢出雜合性缺失、單親二體位點，SNP芯片基于基因分型的原理可以檢出這類異常，這對于基因組中印跡基因相關(guān)疾病、常染色體隱性遺傳疾病的診斷非常重要。

1．2 不平衡性染色體結(jié)構(gòu)變異 相對于傳統(tǒng)核型分析技術(shù)，基因芯片可以對染色體的不平衡變異進(jìn)行更高分辨率的檢測。對于核型分析技術(shù)可以檢出的異常，基因芯片可以給出更精確的異常位點，這對于基因型表型關(guān)聯(lián)分析有重要意義。對于核型分析技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的衍生染色體以及標(biāo)記染色體，基因芯片技術(shù)可以明確檢出不明遺傳物質(zhì)的來源和性質(zhì)，有助于進(jìn)行更準(zhǔn)確的遺傳咨詢。更重要的是，高分辨率的基因芯片技術(shù)可以檢出亞顯微水平的微缺失/微重復(fù)，在產(chǎn)后病例中的大規(guī)模應(yīng)用使得一大批微缺失/微重復(fù)綜合征被發(fā)現(xiàn)。Menten等［10］在2007年報道了3例由比較基因組雜交芯片檢測到的12q14微缺失綜合征患者，3名患者的共同表型有脆弱性骨硬化、身材矮小、智力低下以及相似的面部特征，此外還有15q13．3微缺失綜合征、17q21．31微缺失綜合征等［11］。根據(jù)相同微缺失/微重復(fù)綜合征患者中最小的CNV共同區(qū)域，可以定位并找到致病基因，近年來新克隆的常染色體致病基因有：Smith-Magenis綜合征的致病基因RAI［12］、12q14 微缺失綜合征中與身材矮小相關(guān)的基因HMGA2［13］、17q21微缺失綜合征的致病基因MAPT［14］。應(yīng)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷能有效避免這類患兒的出生。

1．3 嵌合體 嵌合體是指在同一個體中存在遺傳物質(zhì)不同的細(xì)胞系，甚至異常細(xì)胞在同一個體的不同組織、器官中所占的比例都不同。產(chǎn)前診斷中嵌合體存在真性嵌合和假性嵌合的情況，包括胚胎外組織和(或)胚胎組織的嵌合以及體外培養(yǎng)過程中人工造成的假性嵌合等。另外，由于培養(yǎng)過程中正常細(xì)胞相對異常細(xì)胞具有生長優(yōu)勢，經(jīng)過培養(yǎng)后嵌合情況往往會降低從而不容易被檢出?；蛐酒夹g(shù)可以直接使用未培養(yǎng)過的細(xì)胞進(jìn)行檢測從而得到更真實的檢測結(jié)果。產(chǎn)前FISH檢測同樣可以直接對未培養(yǎng)過的細(xì)胞進(jìn)行檢測，但其檢測結(jié)果只針對5條染色體，基因芯片則可以對全部染色體的嵌合情況進(jìn)行檢測。研究數(shù)據(jù)表明，基因芯片技術(shù)對嵌合體的診斷相對于核型分析技術(shù)有更高的靈敏度，可檢出嵌合比例僅為10%甚至更低比例的嵌合體［15］。也有報導(dǎo)稱基因芯片對于嵌合體的檢出需結(jié)合染色體核型分析結(jié)果，否則有可能將單純的缺失/擴增與嵌合體的情況混淆［16］。

2 基因芯片技術(shù)在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的關(guān)鍵問題

2．1 樣本的入選 傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷的入選標(biāo)準(zhǔn)常包含以下幾點：有家族史的病例、高齡產(chǎn)婦、血清學(xué)篩查結(jié)果呈陽性、產(chǎn)前影像學(xué)檢測結(jié)果異常?？紤]到基因芯片的成本相對較高，目前大部分研究機構(gòu)在使用基因芯片進(jìn)行產(chǎn)前診斷時會采用較嚴(yán)格的入選標(biāo)準(zhǔn)，主要針對死胎、流產(chǎn)或影像學(xué)檢測提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒。入選標(biāo)準(zhǔn)越嚴(yán)格則檢出率越高，Shaffer等［17］對5003例產(chǎn)前病例進(jìn)行基因芯片檢測時，發(fā)現(xiàn)病理性CNV檢出率在死胎或流產(chǎn)病例、核型正常影像學(xué)異常病例以及所有入選人群中(包括有家族史的、高齡產(chǎn)婦、血清學(xué)篩查陽性、影像學(xué)檢測結(jié)果異常等)分別為8．2%，6．5%，和5．3%。影像學(xué)檢測是產(chǎn)前對胎兒情況進(jìn)行觀測的有力手段，對于影像學(xué)檢測結(jié)果異常但核型分析結(jié)果正常的樣本進(jìn)行基因芯片檢測是各研究機構(gòu)常用的一個入選標(biāo)準(zhǔn)［18-21］。然而，產(chǎn)后病例中發(fā)現(xiàn)的一些與生長發(fā)育、智力低下等相關(guān)的微缺失/微重復(fù)綜合征在進(jìn)行產(chǎn)前影像學(xué)檢測時往往不會有特異的表型，且發(fā)病概率與孕婦的年齡并無明顯關(guān)系，由此部分研究機構(gòu)認(rèn)為應(yīng)對所有進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的樣本都進(jìn)行基因組芯片分析［22，23］。但由于CNV臨床意義判讀的復(fù)雜性，如果沒有影像學(xué)檢測的異常結(jié)果作為前提，對那些目前臨床意義尚不明確的CNV性質(zhì)進(jìn)行判定就更加困難。對于這類無明確臨床指征的孕婦，選用低分辨率的或者只針對已知微缺失/微重復(fù)綜合征的定制性芯片一方面可以對亞顯微水平的已知致病位點進(jìn)行檢測，另一方面也規(guī)避了臨床意義不明的CNV的檢出。當(dāng)然，使用定制芯片無法在全基因組范圍進(jìn)行拷貝數(shù)檢測，當(dāng)基因芯片數(shù)據(jù)不斷積累、新的致病位點不斷被發(fā)現(xiàn)時，需要重新設(shè)計定制芯片的探針位點。另外，母源樣本的混入會影響芯片結(jié)果的判斷，比如羊水穿刺過程中混入的母血以及CVS樣本中很難全部去除的母親子宮蛻膜，為了得到更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，入選樣本在進(jìn)行芯片檢測前需采用STR位點分析或商業(yè)化試劑盒等進(jìn)行母源污染檢測［24］。

2．2 芯片結(jié)果的分析與驗證 分析芯片結(jié)果時首先需通過軟件處理，將掃描的雜交熒光信號轉(zhuǎn)化為芯片上各探針位點的雜交信號，以便于進(jìn)行基因組的拷貝數(shù)分析。各芯片產(chǎn)品都帶有配套的數(shù)據(jù)分析軟件，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后再采用特定的數(shù)學(xué)算法計算得到樣本的拷貝數(shù)情況［25］。研究人員在使用分析軟件時，可以按照自己的檢測需求以及原始的熒光數(shù)據(jù)質(zhì)量來設(shè)定并調(diào)整分析軟件的相關(guān)參數(shù)來調(diào)整檢測結(jié)果的靈敏度和分辨率，從而得到最優(yōu)的分析結(jié)果。對于軟件參數(shù)的設(shè)定可以參考文獻(xiàn)中報道的對同類芯片產(chǎn)品的使用經(jīng)驗同時結(jié)合自己的實驗?zāi)康?，通過對已知拷貝數(shù)異常樣本的預(yù)實驗檢測以及逐漸積累的數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗來選擇本實驗室的最佳參數(shù)。過濾參數(shù)的設(shè)定越嚴(yán)格則分析得到的CNV數(shù)量就越少，從而有可能導(dǎo)致漏檢，越寬松則檢出的CNV數(shù)量越多，但其中的小片段CNV、假陽性片段也會增加，這些CNV的檢出會大大增加結(jié)果驗證負(fù)擔(dān)。根據(jù)CNV的致病原理，包含有相當(dāng)遺傳物質(zhì)的CNV更有可能致病，對產(chǎn)后大規(guī)模的智力低下/先天畸形患兒的基因芯片檢測結(jié)果表明致病性CNV 的片段長度中值為 1．5Mb［26］，且 95%以上的致病性CNV片段大小在500Kb以上［27-29］。包含多個探針的大片段CNV很容易判定其真實性，而涉及探針數(shù)較少、片段較小的CNV則有可能是假陽性結(jié)果，尤其是在芯片原始數(shù)據(jù)質(zhì)控不佳時更應(yīng)當(dāng)注意。盡管各商家已經(jīng)對芯片產(chǎn)品的試劑盒進(jìn)行了多次優(yōu)化，只要按照試劑盒的要求進(jìn)行操作一般會達(dá)到質(zhì)控要求，但實際操作中一些影響因素：樣本制備、實驗操作、實驗條件等都有可能使得最終的實驗結(jié)果質(zhì)控數(shù)據(jù)不完美從而影響軟件分析的準(zhǔn)確性。對軟件參數(shù)進(jìn)行調(diào)整以及大量數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗的積累都有助于避免大量片段較小、假陽性 CNV的檢出［30］。

芯片檢出的CNV需經(jīng)過另外1～2種分子檢測手段進(jìn)行驗證來明確其真實性，常用的方法包括上文提到的FISH、熒光定量PCR、多重探針連接擴增技術(shù)(MLPA)［31］等。其中FISH是最直觀的驗證方法，可以在分裂中期染色體中明確標(biāo)記出CNV所在位置以及CNV變異的方向(缺失/重復(fù))，但實際應(yīng)用過程中商業(yè)化探針種類有限，一些CNV的驗證需要實驗室自制熒光探針；MLPA檢測通量中等，一次反應(yīng)可以對多處CNV進(jìn)行驗證，但該技術(shù)中雜交探針的設(shè)計位點對GC含量等有一定要求，不能在全基因組范圍內(nèi)靈活使用；熒光定量PCR方法的靈活度較高，是最常用的驗證方法，但一次反應(yīng)所覆蓋的DNA片段較小(200-300bp)，在驗證片段較大的CNV時，應(yīng)在CNV內(nèi)選取多個位點來進(jìn)行驗證。

2．3 檢出CNV的臨床意義分析 現(xiàn)階段人們對人類基因組的結(jié)構(gòu)變異認(rèn)識還并不完全，一些CNV的臨床意義尚不明確。研究表明，人類基因組可能在一定程度上對CNV存在耐受性，另外一些遺傳調(diào)控因素或是外界環(huán)境因素的作用也使得一些綜合征在臨床癥狀上出現(xiàn)表型差異和不完全外顯的情況［32］，此外，正常人群基因組中也存在著大量的拷貝數(shù)變異［6］，以上這些因素都使得CNV臨床意義的分析更加復(fù)雜。考慮到產(chǎn)前診斷的責(zé)任重大，對于產(chǎn)前檢出的CNV的臨床意義分析更應(yīng)慎重。正常人群基因組中存在的常見CNV或是良性CNV往往沒有臨床意義，為了避免對這類CNV進(jìn)行耗時且沒有意義的驗證工作，在進(jìn)行CNV臨床意義分析前可以從檢測結(jié)果中排除掉這類CNV。人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants，DGV)中收集了各研究機構(gòu)在正常人群中檢測到的CNV，可以用于參考以排除檢測結(jié)果中的常見CNV。但值得注意的是并非所有DGV數(shù)據(jù)庫中所列出的CNV都是沒有臨床意義的，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些在 DGV中收錄的CNV區(qū)域其實是病理性CNV，會引發(fā)確定的臨床表現(xiàn)，比如 1q21．1 和 16p11．2 等區(qū)域［33，34］，一些常見CNV 有可能在純和狀態(tài)下致病［35，36］。另外，研究表明CNV的存在是具有種族差異的，一項在高加索人和亞洲人群中進(jìn)行CNV的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在總共檢測到的3019個CNV中有109個在2個種族中有顯著差異［37］。為了更準(zhǔn)確排除所研究人群中的常見CNV，一些研究機構(gòu)會在進(jìn)行患者CNV檢測之前選取同種族的一批正常人進(jìn)行同款芯片平臺的檢測，建立本實驗室的常見CNV數(shù)據(jù)庫。這樣做既避免了不同種族間CNV差異帶來的CNV臨床意義的誤判也消除了不同芯片操作過程中的誤差。

病理性CNV常包含微缺失/微重復(fù)綜合征的關(guān)鍵區(qū)域或是致病基因，在相同區(qū)域反復(fù)多次出現(xiàn)的CNV的基因型-表型關(guān)聯(lián)研究使得越來越多的微缺失/微重復(fù)綜合征被發(fā)現(xiàn)［10，11，38］。DECIPHER 數(shù)據(jù)庫中收集了各種反復(fù)出現(xiàn)在同一區(qū)域并且導(dǎo)致相似表型的CNV，包括已經(jīng)確認(rèn)的綜合征以及其他的僅列出相關(guān)表型的病理性CNV。OMIM數(shù)據(jù)庫收集了致病基因的相關(guān)功能研究和相關(guān)的綜合征表型。可以參考這些數(shù)據(jù)庫明確檢測到的病理性CNV和潛在致病性CNV。當(dāng)然，這些數(shù)據(jù)庫中一些發(fā)生率低的罕見CNV有可能會隨著芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用而在越來越多的正常人群中被檢測到從而重新被劃分為常見CNV。

在判斷CNV臨床意義過程中還應(yīng)判斷的一點就是所檢測到的CNV是否為新發(fā)CNV，在收集產(chǎn)前樣本時應(yīng)同時收集胎兒父母的樣本，以便于對檢出的CNV立即進(jìn)行來源分析。一般來說由表型正常的父母遺傳而來的CNV在很大程度上不會對胎兒的表型造成影響。當(dāng)然，這一論斷并不是絕對的，因為人類基因組的復(fù)雜組成和調(diào)控機制，嵌合、不完全外顯或是環(huán)境因素等都會導(dǎo)致表型的多變。近來報道的引起1q21和15q13．3微缺失綜合征的CNV曾多次在患者表型正常的雙親中檢測到［34，36］；微重復(fù)綜合征的臨床表現(xiàn)的外顯程度更加多變，22q11．2微重復(fù)綜合征患者的表現(xiàn)常常變化很大，也有很多患者是遺傳自表型正常的父母［39］；另外涉及到X染色體的CNV如果是遺傳自母親，X染色體失活機制往往使得母親攜帶者沒有表型或是只有輕微表型［40］。在參考胎兒父母中CNV的情況時仍要綜合考慮公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)中的信息來對檢出CNV的臨床意義進(jìn)行分析。

從長遠(yuǎn)看來，基因芯片的大規(guī)模使用會積累大批量的數(shù)據(jù)結(jié)果，在這過程中越來越多的CNV的臨床意義會逐漸被明確。

2．4 臨床咨詢 CNV臨床意義的復(fù)雜性使得產(chǎn)前芯片的臨床咨詢更具挑戰(zhàn)性。在進(jìn)行產(chǎn)前基因芯片檢測之前，應(yīng)做好胎兒父母的相關(guān)信息告知工作，使得胎兒父母充分了解芯片檢測的潛在優(yōu)勢和技術(shù)不足、所有可能的檢測結(jié)果以及采集父母的外周血的用途，提供詳盡的知識講解和非指示性的知情同意條款以供胎兒父母做出自主選擇。知情同意書中應(yīng)列出基因芯片可能檢出結(jié)果：與產(chǎn)前影像學(xué)異常相對應(yīng)的病理性CNV；與產(chǎn)前影像學(xué)異常無關(guān)的病理性CNV；臨床意義尚不明確的新發(fā)性CNV；臨床意義尚不明確的遺傳性CNV；與某些遲發(fā)性疾病相關(guān)的CNV、某些疾病的易感性CNV等。在進(jìn)行遺傳咨詢時，實驗室技術(shù)人員與遺傳咨詢?nèi)藛T應(yīng)做好交接工作，遺傳咨詢?nèi)藛T需對整個基因芯片操作、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果驗證等工作都有詳細(xì)認(rèn)識，通過查詢相關(guān)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，討論并對檢出數(shù)據(jù)的臨床意義進(jìn)行分析。對于明確的病理性CNV(已知的微缺失/微重復(fù)綜合征)的遺傳咨詢，應(yīng)給出該CNV(綜合征)可能造成的臨床表型和應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行的檢測(如有需要)。從倫理的角度出發(fā)，基因芯片檢測有可能檢出臨床意義不明的CNV、成年后才致病的CNV、胎兒為某些疾病的攜帶者等情況［41］。目前對這類數(shù)據(jù)是否應(yīng)當(dāng)報告給患者尚無一致看法，一些機構(gòu)會讓患者自主選擇是否告知，較常用的方法是只對臨床意義明確的病理性CNV出具報告，以免造成胎兒父母的不必要的恐慌情緒。

3 結(jié)論

基因芯片技術(shù)相對于其他產(chǎn)前診斷技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測中可以對全基因進(jìn)行高分辨率的掃描，相對于傳統(tǒng)核型分析大大提高了檢出率。采用未培養(yǎng)過的細(xì)胞直接進(jìn)行檢測，避免了人工培養(yǎng)過程造成的異常，同時也縮短了檢測時間?；诨蛐酒倪@些優(yōu)勢，越來越多的研究機構(gòu)將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。基因芯片技術(shù)相對于其他產(chǎn)前診斷技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)不平衡性變異檢測中顯示了極大的優(yōu)勢，但不足以檢測平衡性變異，此外，實際產(chǎn)前診斷應(yīng)用過程中的所有關(guān)鍵問題都應(yīng)當(dāng)有完善的處理方案，這樣產(chǎn)前基因芯片診斷才能有效發(fā)揮其檢測能力。

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