趙元淑，羅淼珊，鄧 鎮(zhèn)，謝 柳，余 涵，胡景鑫，朱曉琴，雷水生

顳葉癲癇是難治性癲癇的一種，主要病理表現(xiàn)為海馬硬化和神經(jīng)元丟失。傳統(tǒng)的手術(shù)治療會出現(xiàn)言語記憶減退等副作用［1］。研究表明細(xì)胞移植可以產(chǎn)生顯著的療效［2］。γ-氨基丁酸(GABA)是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有抑制癲癇發(fā)作的作用。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA 合成的唯一的限速酶，GAD 的含量和活性直接決定GABA 的濃度。GAD65 是GAD 的一種亞型，在發(fā)揮持續(xù)抑制、調(diào)節(jié)癲癇活動中起重要作用［3］。提高腦內(nèi)GAD65 的濃度可以促進(jìn)GABA 的生成，而使用GAD65 修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療癲癇尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了GAD65 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，并對其在細(xì)胞中的表達(dá)做了初步鑒定，為進(jìn)一步干細(xì)胞移植奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為基因治療和細(xì)胞移植聯(lián)合治療癲癇提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 真核表達(dá)載體pCDNA3.1 購于深圳百恩維公司，大腸桿菌DH5α 購于天根生化公司，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購于北京全式金生物公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 連接酶購于美國NEB 公司，RNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒購于Takara，Lip2000、Trizol 購于Invitrogen，一抗來自Abcam;二抗購于北京中杉金橋，胎牛血清FBS、低糖DMEM 購于Gibco。動物:成年SD 大鼠及4 周齡SD大鼠，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 成年SD 大鼠腦組織50mg，液氮中研磨，按Trizol 說明書步驟提取鼠腦總RNA。以鼠腦總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)為引物，逆轉(zhuǎn)錄生成GAD65 的cDNA。根據(jù)Genbank 提供的大鼠GAD65 編碼序列設(shè)計(jì)引物。上游引物5’-AGTGAATTCAGAACCCATGGCATGGCATCTCC-3’，下游引物5’-CGTCCAGCTCGAGCAAAGTGATTACAA-3’。上下游引物分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以cDNA 為模板，用高保真DNA 聚合酶對GAD65 基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min，94℃30s，59℃3min，37 個循環(huán)，最后72℃延伸8min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。EcoRⅠ、XhoⅠ酶切GAD65 和pCDNA3.1 真核表達(dá)載體，回收目的基因片段和pCDNA3 真核質(zhì)粒片段。用T4 連接酶將上述兩片段定向連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于LB 瓊脂平板上，挑取白色克隆接種在LB 培養(yǎng)基中。抽提重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pCDNA3.1-GAD65。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切該質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送上海英濰捷基公司測序。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取4w 健康雄性SD 大鼠1 只，脫頸處死后浸泡于75%酒精中5min，于無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨，迅速放于PBS 中，剪除骨膜及軟組織(盡量剪干凈)，切斷干骺端，暴露骨髓腔，取5ml 注射器吸取培養(yǎng)液(10%FBS，1%雙抗，90%DMDM)反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔變白為止。將沖洗液反復(fù)吹打均勻，接種于100mm 平皿，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中。24h、48h 全換液，以后隔天全換液。5～7d細(xì)胞長滿平皿底，細(xì)胞達(dá)到90%融合時用胰酶消化，1∶2 傳代。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，2～3d 傳代一次。轉(zhuǎn)染前一天將P3 代細(xì)胞接種于六孔板中以備轉(zhuǎn)染。將待轉(zhuǎn)染的BMSCs 分成3 組:A組:轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-GAD65 組;B 組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCDNA3.1 組;C 組:未轉(zhuǎn)染組。將DNA 和脂質(zhì)體按1∶3 的比例分別加入250μl 無血清培養(yǎng)基Optimem 中，混合反應(yīng)20min;吸出培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗兩遍，加入1.5ml Opti-mem，將DNA、脂質(zhì)體混合液加入6 孔板(C 組只加無血清培養(yǎng)基)，反應(yīng)6h 后，吸出轉(zhuǎn)染液，加入正常培養(yǎng)液;細(xì)胞培養(yǎng)48h 后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測mRNA 表達(dá) 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗一遍，加入1ml Trizol，提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;以cDNA 為模板，上游引物5’-ACGCACTGCCAAACAACTCTA-3’，下游引物5’-GACATCAGTAACCCTCCACCC-3’進(jìn)行熒光定量PCR。擴(kuò)增條件:95℃30s;95℃5s;60℃34s;共40 個循環(huán)。溶解曲線設(shè)置為:95℃ 15s;60℃ 1min;95℃15s。用△△CT 值比較法處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 免疫熒光檢測BMSCs 中GAD65 的表達(dá) 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 遍，冰甲醇固定10min，0.3%TritonX-100 室溫通透10min，山羊血清室溫封閉30min，一抗4℃封閉過夜，次日復(fù)溫30min 后;二抗37℃避光孵育2h，DAPI 染核，5%甘油封片鏡檢。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h 后吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS 沖洗3 遍，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取適量蛋白行SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白用濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印到PCDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，一抗4℃封閉過夜，TBST 洗膜，加入二抗室溫孵育1h，TBST洗膜，ECL 發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果顯示:1～4 泳道均顯示擴(kuò)增出1758bp 大小的目的基因片段和大小為5428bp 的pCDNA3.1 基因片段，與預(yù)期大小一致。將菌落PCR 和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定均為陽性的克隆送往公司測序，并與Genbank 中GAD65 的基因序列比對。測序結(jié)果顯示，目的基因序列與NCBI 公布的參考序列完全一致，無讀碼框移，以上結(jié)果證明pCDNA3.1-GAD65 重組真核質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后BMSCs 中GAD65 mRNA 的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h 后，提取各組細(xì)胞總RNA，檢測GAD65 mRNA 在各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示:pCDNA3.1-GAD65 轉(zhuǎn)染組的GAD65 mRNA(203911.668±16064.279)較未轉(zhuǎn)染組(0.835±0.183)和pCDNA3 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(0.461±0.129)有明顯的升高(P＜0.05)，而未轉(zhuǎn)染組和pCDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 免疫熒光檢測BMSCs 中GAD65 的表達(dá)免疫熒光檢測各組GAD65 蛋白表達(dá)情況，并且初步估計(jì)轉(zhuǎn)染率。pCDNA3.1-GAD65 轉(zhuǎn)染組顯示GAD65 蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)均勻表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見GAD65 表達(dá)。這證明pCDNA3.1-GAD65 能夠成功地被轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，并正確過表達(dá)目的蛋白。

2.4 Western blot 檢測BMSCs 中GAD65 的表達(dá) Western blot 檢測pCDNA3.1-GAD65 轉(zhuǎn)染組、pCDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組GAD65 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示pCDNA3.1-GAD65 轉(zhuǎn)染組過表達(dá)GAD65 蛋白，而pCDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組未檢測到GAD65 蛋白表達(dá)。

3 討論

癲癇是由于大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電導(dǎo)致大腦功能障礙的一種慢性疾病。癲癇的發(fā)作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的興奮-抑制失衡有關(guān)［4～6］。部分難治性癲癇患者可以接受手術(shù)治療，但并非所有難治性癲癇患者都適宜手術(shù)，特別是癲癇灶彌散或不明確者并不具備傳統(tǒng)手術(shù)的手術(shù)指征，而且傳統(tǒng)手術(shù)遠(yuǎn)期療效只有60%左右，因此有必要探索更安全、更有效的新治療方案。

近年來，干細(xì)胞移植治療癲癇的方法越來越獲得關(guān)注，因?yàn)楦杉?xì)胞具有產(chǎn)生內(nèi)源性抗驚厥物質(zhì)、替換損傷神經(jīng)元的作用，可以用于癲癇的治療［7，8］。但是，由于胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等在取材方面存在限制，嚴(yán)重影響了其在臨床中的應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)免疫原性小，取材方便，能誘導(dǎo)分化成骨軟骨、脂肪、心肌、神經(jīng)元等各種細(xì)胞［9］。這些特點(diǎn)讓骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床治療中獲得更多的應(yīng)用［10］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植已經(jīng)在治療脊髓損傷和自身免疫性疾病方面取得了顯著的治療效果［11，12］。因此，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞在移植中可以作為一個理想的種子細(xì)胞。

γ-氨基丁酸(GABA)是腦內(nèi)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，癲癇的反復(fù)發(fā)作可以引起腦內(nèi)GABA 能神經(jīng)元缺失，從而導(dǎo)致不同程度的癲癇發(fā)作［13］。向腦內(nèi)定向移植GABA 能細(xì)胞可以抑制癲癇的發(fā)作。谷氨酸脫羧酶(GAD)是GABA 合成的限速酶，其存在兩種異構(gòu)體，即GAD65 和GAD67。GAD65 主要存在于神經(jīng)突觸中，GAD67 則均勻地分布于神經(jīng)元的胞體。兩種異構(gòu)體由于活化和細(xì)胞定位不同而被賦予不同的功能。GAD67 基因敲除的小鼠先天發(fā)育異常，出生后不久死亡;而GAD65 基因敲除的小鼠出現(xiàn)癲癇自發(fā)性發(fā)作［14］。因此，GAD65 在癲癇的發(fā)作中具有重要的作用。GAD65 基因修飾BMSCs 可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生高濃度的GAD65，移植GAD65-BMSCs 可以起到補(bǔ)充GABA 能細(xì)胞的作用。

通過基因工程化細(xì)胞治療疾病是近期研究的熱點(diǎn)。將基因轉(zhuǎn)染入特定的細(xì)胞中，使其過表達(dá)或沉默某種基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)將GAD65 基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞，以期注入腦內(nèi)產(chǎn)生高濃度的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA，從而達(dá)到治療癲癇的目的。

在實(shí)驗(yàn)中我們依據(jù)真核質(zhì)粒安全、無病毒突變危險、可以應(yīng)用于臨床等優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建pCDNA3.1-GAD65 真核載體，并將其轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過RT-PCR、免疫熒光、Western-blot 等鑒定，證實(shí)GAD65 基因在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，這為進(jìn)一步探索攜帶GAD65 的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療癲癇奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］Wilson CL，Maidment NT，Shomer MH，et al.Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic，kainate rat model of hippocampal epilepsy［J］.Epilepsy Res，1996，26(1):245－254.

［2］Simantov R，Crispino M，Hoe W，et al.Changes in expression of neuronal and glial glutamate transporters in rat hippocampus following kainate-induced seizure activity［J］.Brain Res Mol Brain Res，1999，65(1):112－123.

［3］Friedman LK，Pellegrini-Giampietro DE，Sperber EF，et al.Kainateinduced status epilepticus alters glutamate and GABAA receptor gene expression in adult rat hippocampus:an in situ hybridization study［J］.J Neurosci，1994，14(1):2697－2707.

［4］Walls AB，Nilsen LH，Eyjolfsson EM，et al.GAD65 is essential for synthesis of GABA destined for tonic inhibition regulating epileptiform activity［J］.J Neurochem，2010，115(6):1398－1408.

［5］Gleissner U，Helmstaedter C，Schramm J，et al.Memory outcome after selective amygdalohippocampectomy:a study in 140 patients with temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2002，43(1):87－95.

［6］Turner DA，Shetty AK.Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy［J］.Neurosurgery，2003，52(3):632-644.

［7］Raedt R，Boon P.Cell therapy for neurological disorders:a comprehensive review［J］.Acta Neurol Belg，2005，105(3):158－170.

［8］Madhavan L，Collier TJ.A synergistic approach for neural repair:cell transplantation and induction of endogenous precursor cell activity［J］.Neuropharmacology，2010，58(6):835－844.

［9］胡資兵，曾 榮，郭偉韜，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化特征［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008(43):8561－8566.

［10］Ding DC，Shyu WC，Lin SZ.Mesenchymal stem cells［J］.Cell Transplant，2011，20(1):5－14.

［11］Uccelli A，Prockop DJ.Why should mesenchymal stem cells(MSCs)cure autoimmune diseases［J］.Curr Opin Immunol，2010，22(6):768－774.

［12］Vaquero J，Zurita M.Functional recovery after severe CNS trauma:current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells［J］.Prog Neurobiol，2011，93(3):341－349.

［13］Loscher W，Schwark WS.Evaluation of different GABA receptor agonists in the kindled amygdala seizure model in rats［J］.Exp Neurol，1985，89(2):454－460.

［14］Kash SF，Johnson RS，Tecott LH，et al.Epilepsy in mice deficient in the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(25):14060－14065.