杰吉甫楊志剛

（1 新疆庫爾勒市巴音郭勒蒙古族自治州衛(wèi)生學(xué)校解剖教研室，新疆 巴州 841000；2 北方民族大學(xué)管理學(xué)院，甘肅 銀川 750004）

ELK-1與原發(fā)性高血壓大鼠左心室重構(gòu)關(guān)系的研究

杰吉甫1楊志剛2

（1 新疆庫爾勒市巴音郭勒蒙古族自治州衛(wèi)生學(xué)校解剖教研室，新疆 巴州 841000；2 北方民族大學(xué)管理學(xué)院，甘肅 銀川 750004）

目的研究ELK-1在原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）左心室的表達(dá)情況，探討ELK-1與高血壓左心室重構(gòu)的關(guān)系。方法對比觀察各周齡SHR大鼠與WKY大鼠血壓，心臟/體質(zhì)量比值變化；RT-PCR方法檢測左心室ELK-1的表達(dá)。結(jié)果在整個實驗過程中，WKY血壓保持在正常水平，24周齡SHR組尾動脈收縮壓明顯高于同周齡WKY組（P＜0.05）；與同周齡WKY相比24周齡SHR組的心臟/體質(zhì)量比值增加明顯（P＜0.05）；大鼠左心室肌經(jīng)RT-PCR檢測分析，隨周齡增加SHR左心室中ELK-1含量逐漸增高，24周齡的SHR組含量明顯高于同周齡WKY組大鼠（P＜0.05），且24周齡大鼠的含量明顯高于8周齡大鼠的（P＜0.05）。結(jié)論ELK-1可能對高血壓左心室心肌肥厚發(fā)展有促進(jìn)作用。

高血壓；左心室肥厚；SHR；ELK-1

心臟是高血壓直接損傷的重要靶器官之一，高血壓所致的心室壁增厚和心室?guī)缀螛?gòu)型改變稱為高血壓心臟重構(gòu)。心肌重構(gòu)在心臟功能補(bǔ)償中發(fā)揮重要作用，但是心肌細(xì)胞的持續(xù)的病理性肥大、增生，并協(xié)同纖維化的發(fā)展最終擾亂了心臟正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和心肌收縮功能。臨床試驗證實，高血壓患者盡管血壓得到長期有效控制，其左心室厚度仍逐漸增加，成為高血壓心血管并發(fā)癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高血壓心臟重構(gòu)是一復(fù)雜的病變過程，血流動力學(xué)及神經(jīng)體液等多種因素參與了高血壓心臟重構(gòu)。作為ETS家族成員之一的轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1（ELK-1）在細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中起重要作用[1]，而轉(zhuǎn)錄激活因子ELK-1是否參與了高血壓大鼠左心室重構(gòu)尚不清楚。本實驗采用RT-PCR技術(shù)觀察轉(zhuǎn)錄激活因子ELK-1在SHR大鼠左心室重構(gòu)中的表達(dá)改變，探討高血壓左心室重構(gòu)與ELK-1之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性WKY大鼠和雄性自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠各10只，均購自北京維通利華實驗動物有限公司。trizol購自美國invitrogen生命技術(shù)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas生命技術(shù)有限公司，2×MIX購自美國OMEGA生命技術(shù)有限公司，引物購自北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司，6×loading buffer購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)限公司，DEPC水購自AMRESCO生物技術(shù)公司，DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)限公司。

1.2 動物分組

①WKY大鼠作為對照組：8周齡組（W1），24周齡組（W2）每組各5只。②SHR大鼠為高血壓組：8周齡組（S1），24周齡組（S2）每組各5只。

1.3 標(biāo)本留取

各組大鼠分別在設(shè)定時間點(diǎn)，經(jīng)腹腔注射3%的戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，迅速取出心臟，裝入凍存管中、標(biāo)記，投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR及圖像處理

取100mg左心室心肌組織用1mltrizol研磨提取mRNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，無菌無酶的蒸餾水代替mRNA作為陰性對照，反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供陽性對照。引物由試劑公司設(shè)計ELK-1F 5'CATCATCTGCTCCTCGACACG3'，ELK-1R 5' GTCATTGCACCTCCCTTTGG 3'。PCR具體步驟按照2×MIX說明書進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，用標(biāo)準(zhǔn)分子量MARK比較判斷PCR片段大小。以β-actin為內(nèi)參，利用Quatity One軟件對圖片進(jìn)行分析。

1.5 結(jié)果觀察

預(yù)冷的PBS沖洗心臟，濾紙吸干水份后稱量心臟重量（HW）。計算心臟/體質(zhì)量比值（mg/g）。在陽性對照出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增條帶，陰性對照無擴(kuò)增條帶時判定結(jié)果。用β-actinR/β-actinF檢測，出現(xiàn)大小為321bp擴(kuò)增片段時，判定為內(nèi)參β-actin陽性，否則判定為陰性。用ELK-1R/ELK-1F檢測，出現(xiàn)大小為351bp擴(kuò)增片段時，判定為內(nèi)參β-actin陽性，否則判定為陰性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件包完成，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ—±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 血壓變化

整個實驗過程中，WKY組大鼠收縮壓基本保持在正常水平（109.58±5.61mmHg）。SHR組大鼠從8周齡開始血壓升高，S2組動脈收縮壓均明顯高于同周齡的W2組（P＜0.05）。

2.2 SHR心臟/體質(zhì)量比值變化

隨著周齡的增加SHR大鼠和WKY大鼠的心臟/體質(zhì)量比值逐漸增加，S2組大鼠的心臟/體質(zhì)量比值明顯高于S1組大鼠（P＜0.05）及同周齡W2組大鼠。

2.3 RT-PCR結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測ELK-1的PCR 產(chǎn)物結(jié)果顯示，我們得到了特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的片段大?。?51bp）一致，而且沒有非特異條帶的干擾，擴(kuò)增特異性較強(qiáng)。大鼠左心室肌組織經(jīng)RT-PCR檢測分析，隨周齡增加SHR左心室中ELK-1含量逐漸增高，S2組含量明顯高于同周齡W2組大鼠（P＜0.05），且24周齡大鼠的含量明顯高于8周齡大鼠的（P＜0.05）。

3 討 論

心臟作為高血壓病的直接受累的重要靶器官，在長期高血壓狀態(tài)下，左心室后負(fù)荷持續(xù)增加，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了一些列改變，稱為心臟重構(gòu)，以左心室肥厚為主[2]。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法，證實ELK-1可能對高血壓左心室心肌肥厚發(fā)展有促進(jìn)作用。

Elk-1是TCF 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一[5,6]，受到諸如細(xì)胞因子及紫外線燈等的刺激，轉(zhuǎn)錄因子ELK-1被磷酸化并激活，進(jìn)而對細(xì)胞的生長、分化及凋亡產(chǎn)生影響，這一過程是絲列原活化蛋白激酶（MAPK）介導(dǎo)的，而且ELK-1是三種MAPK成員共同的的下游靶分子。MAPK超家族包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERKs），應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPKs）或c-jun 氨基末端激酶（JNKs）通路和P38絲裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）通路[7-12]。

Izumi等在5，8，14和24周齡的自發(fā)性高血壓腦卒中大鼠的心臟中測定ERK活性，發(fā)現(xiàn)左室ERK活性在輕度血壓增高期顯著高于同齡WKY大鼠，直至左室肥厚期仍保持在高水平，而無肥厚表現(xiàn)的右心室不顯示ERK的高活性[3]。Kagiyama等用反義寡核苷酸表皮生長因子受體阻斷SHR ERK途徑后，ERK活化程度降低，左室重/體質(zhì)量比明顯下降[4]。安欣等利用WKY和SHR大鼠研究顯示 ：自發(fā)性高血壓大鼠隨周齡的增加，心臟改變主要表現(xiàn)為向心性重構(gòu)和向心性肥厚。PD98059阻斷ERK1/2后，能夠明顯減少相對左心室壁厚度，一定程度上減緩高血壓心臟重構(gòu)[13]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為：MAPK的過度活化與心肌細(xì)胞肥大、平滑肌細(xì)胞增殖密切相關(guān)[16,17]。轉(zhuǎn)錄激活因子ELK-1的表達(dá)改變可能在慢性房顫心房肌的分子重構(gòu)中起著重要的作用[18]。

綜上所述，我們的結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄激活因子ELK-1可能在高血壓左心室重構(gòu)中起著重要的促進(jìn)作用。在本研究中，盡管我們觀察到隨著周齡的增加SHR大鼠ELK-1的表達(dá)量增加，且24周齡的SHR大鼠表達(dá)量高于同周齡的WKY大鼠，但是轉(zhuǎn)錄激活因子ELK-1與高血壓左心室重構(gòu)間仍然缺乏直接的證據(jù)。在今后的研究中我們需要探討ELK-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)高血壓左心室重構(gòu)的直接證據(jù)。

[1] Buchw alter G,Gross C,Wasylyk B.Ets ternary com p lex transcrip tion factors[J].Gene,2004,324(1)∶1-14.

[2] 張源明,李黎.原發(fā)性高血壓伴房顫患者左心重構(gòu)的特點(diǎn)[J].中華高血壓雜志,2009,17(2)∶141-143.

[3] Izumi Y,Kim S,Murakami T,et al.Cardiac mitogen-activated protein kinase activities are chronically increased in stroke-prone hypertensive rats[J].Hypertens,1998,31(1)∶50-56.

[4] Kagiyama S,Qian K,Kagiyama T,et al.Antisense to epidermal growth factor receptor prevents the development of left ventricular hypertrophy [J].Hypertension,2003,41(3 Pt 2)∶824-829.

[5] Treisman R.Ternary complex factors∶ growth factor regulated transcriptional activators[J].Curr Opin Genet Dev,1994,4(1)∶96-101.

[6] Price MA,Rogers AE,Treisman R.Comparative analysis of the ternary complex factors Elk-1, SAP-1a and SAP-2 (ERP/NET) [J]. EMBO J,1995,14(11)∶2589-2601.

[7] Cavigelli M,DolfiF,Claret FX,et al.Induction of c-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation [J].EMBO J, 1995,14(23)∶5957-5964.

[8] Whitmarsh AJ,Yang SH,Su MSS,et al.Role of p38 and JNK mitogenactivated protein kinases in the activation of ternary complex factors[J].Mol Cell Biol,1997,17(5)∶2360-2371.

[9] Whitmarsh AJ,Shore P,Sharrocks AD,et al.Integration of MAP kinase signal transduction pathways at the serum response element [J].Science,1995,269(5222)∶403-407.

[10] Gille J,Kortenjann M,Thomas O,et al.ERK phosphorylation potentiates Elk-1-mediated ternary complex formation and transactivation[J].EMBO J,1995,14(5)∶951-962.

[11] Price MA,Cruzalegui FH,Treisman R.The p38 and ERK MAP kinase pathways cooperate to activate Ternary Complex Factors and c-fos transcription in response to UV light[J].EMBO J,1996, 15(23)∶6552-6563.

[12] Zinck R,Cahill MA,Kracht M,et al.Protein synthesis inhibitors reveal differential regulation of mitogen-activated protein kinase and stress-activated protein kinase pathways that converge on Elk-1[J].Mol Cell Biol,1995,15(9)∶4930-4938.

[13] 安欣.MAPK家族成員活化表達(dá)參與高血壓心臟重構(gòu)的實驗研究[D].銀川∶寧夏醫(yī)科大學(xué),2010.

[14] 景麗,張建中,呂懷盛,等.高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞中ERK-2和原癌基因c-jun的表達(dá)[J].高血壓雜志,2004,12(4)∶341-344.

[15] 張建忠,景麗,王一理,等.高血壓大鼠VSMC中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和c-jun及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2005,34 (8)∶910-913.

[16] Ichinose F,Bloch KD.Pressure overload-induced LV hypertrophy and dysfunction in mice are exacerbated by congenital NOS3 deficiency[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,286(3)∶H1070-5.

[17] 李淑敏,胡大一,汪麗惠,等.高血壓心肌肥大大鼠心肌絲裂素活化蛋白激酶的活性[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),1996,28(3)∶199.

[18] 曾祥君,肖穎彬,陳林,等.慢性房顫對風(fēng)濕性心臟病心房肌細(xì)胞ELK-1、p-ELK-1表達(dá)的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2007,29 (12)∶1197-1199.

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1671-8194（2013）13-0073-02