柏慧，嚴(yán)光

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，合肥230001)

阿爾茲海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以記憶和其他認(rèn)知功能的漸進(jìn)性喪失為主要特征，病理上主要表現(xiàn)為相關(guān)皮質(zhì)下的老年斑積聚(SPs)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)［1-2］。AD嚴(yán)重影響人們身心健康，可導(dǎo)致持續(xù)性進(jìn)行性癡呆，但目前還無有效治療措施。其患者總數(shù)逐年增加，預(yù)計(jì)到2020年將超過現(xiàn)在的2倍，這個(gè)特殊病人群體的治療費(fèi)用也因?yàn)橹委煷胧┑陌嘿F而不成比例的增加。因此，充分理解AD發(fā)病機(jī)制對(duì)提高預(yù)防治療水平是非常迫切的。人們已對(duì)AD的各種發(fā)病機(jī)制展開了深入的研究，本綜述將對(duì)阿爾茲海默病中G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)功能紊亂的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要總結(jié)。

1 GRKs

1.1 GRKs家族 GRKs首次發(fā)現(xiàn)于受體脫敏過程中，屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。依據(jù)序列同源性可將GRKs分為三組:視紫紅質(zhì)激酶亞家族(GRK1和GRK7)，β腎上腺素受體激酶亞家族(GRK2和GRK3)，GRK4亞家族(GRK4、GRK5 和 GRK6)。這些激酶既有共性也有特性，GRK2、3、5和6廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織中，而GRK1、4和7只存在于個(gè)別器官中。其中GRK1和7表達(dá)于視網(wǎng)膜桿狀和錐狀細(xì)胞，GRK4存在于睪丸、小腦和腎臟［3］。

1.2 GRKs的功能 GRKs在結(jié)構(gòu)上包含一個(gè)中心位于第263-266的氨基酸催化區(qū)，側(cè)面是大的氨基和羧基末端調(diào)節(jié)區(qū)。GRKs的氨基末端調(diào)節(jié)區(qū)的共同區(qū)域論證了結(jié)構(gòu)的同源性。這些結(jié)果暗示了氨基末端調(diào)節(jié)區(qū)可能會(huì)執(zhí)行所有GRKs的一個(gè)共同功能，這個(gè)功能很可能是受體識(shí)別。GRKs的主要功能是使活化的G蛋白偶聯(lián)受體(GRCPs)脫敏化，這個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)過程包括磷酸化活化的受體，解偶聯(lián)G蛋白受體，啟動(dòng)受體內(nèi)在化。GRKs磷酸化激活狀態(tài)下的 GPCRs，受體磷酸化后與抑制蛋白(arrestins)結(jié)合，致受體與G蛋白脫偶聯(lián)，引起受體脫敏。受體與arrestins結(jié)合后，參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，依據(jù)傳統(tǒng)觀點(diǎn)這種內(nèi)吞作用再次激活受體，并將其運(yùn)回質(zhì)膜重新利用［4-5］。因此，位于G蛋白-受體界面的GRKs的主要功能就是使激活狀態(tài)的GRCPs發(fā)生脫敏。

1.3 GRKs的共性和特性 GRKs的體外研究認(rèn)為GRKs的共性可能就是GRKs的七種亞型可以磷酸化不同的GRCPs可能不存在差異性［4］。隨著GRK的轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠的產(chǎn)生，體內(nèi)試驗(yàn)明確證實(shí)了 GRKs的功能特性。例如，缺乏 GRK2，3，5，6的老鼠分別展現(xiàn)出對(duì)腎上腺素、毒蕈堿、多巴胺受體脫敏的選擇性損傷［6-9］。隱藏在體內(nèi)這種功能特異性之下的分子機(jī)制仍有待闡明。

1.4 GRKs的亞細(xì)胞分布 體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)GRK2和GRK5可以磷酸化突觸核蛋白［10］。另有研究報(bào)道GRK的獨(dú)立功能，如GRK5可以抑制核因子NF-κB的活動(dòng)［11-12］。盡管如此細(xì)胞膜上的GRCP仍然是GRKs的主要底物，這一特性決定了GRKs在細(xì)胞膜上執(zhí)行主要功能。GRK4亞家族成員主要位于靜息細(xì)胞的質(zhì)膜上，與磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、磷酸絲氨酸(PS)結(jié)合，可以磷酸化被激動(dòng)劑激活的GRCPs［4］。其他 GRK 亞科主要位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)GRCPs被激活后，才易位到胞膜上執(zhí)行功能。因此，凡是可以改變這些調(diào)節(jié)因子細(xì)胞濃度的因素可能會(huì)改變GRKs的亞細(xì)胞位置及活性。

2 GRKs功能紊亂和AD的聯(lián)系

細(xì)胞水平的健康依賴于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。AD的病理學(xué)特征之一是神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)失衡。主要表現(xiàn)為:(1)某些蛋白激酶的活動(dòng)增強(qiáng)以及某些蛋白磷酸酶酯的活動(dòng)減弱導(dǎo)致神經(jīng)纖維變性［13］;(2)β-淀粉樣蛋白(Aβ)的水解增加以及清除減少導(dǎo)致大腦淀粉樣變［14］;(3)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致神經(jīng)元炎癥性損傷［15］。已有研究發(fā)現(xiàn)AD的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)以過度活躍為特征［16］，尤其歸因于眾多GPCRs及其下游信號(hào)［17］。更具體的說，一些研究者指出信號(hào)傳導(dǎo)缺失的部位在GRKs主要活動(dòng)的受體-G蛋白界面［18］。

2004年，Suo等［19］最早就 GRKs功能紊亂與AD關(guān)系做了研究。他們調(diào)查了低劑量可溶性Aβ預(yù)處理的細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等對(duì)一些GRCP刺激物如凝血酶等非常敏感的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)做過Aβ預(yù)處理后，胞膜上的GRK5迅速轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，而胞質(zhì)里的GRK2沒有被轉(zhuǎn)移至胞膜，使得GRK的活性受抑制，凝血酶信號(hào)通路中的GRCP受體不能及時(shí)脫敏，最終導(dǎo)致預(yù)處理后的細(xì)胞極度活躍。目前對(duì)Aβ改變GRK亞細(xì)胞位置的機(jī)制還不是很清楚。但不難想象的是，Aβ對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和胞膜磷脂的影響在其中起到了非常重要的作用。他們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)TgCRND8轉(zhuǎn)基因小鼠胞膜上GRK2和GRK5含量減少，而胞質(zhì)中GRK2和GRK5含量增加。所有這些改變從AD前驅(qū)期開始一直持續(xù)到晚期階段。之后在AD患者尸體的大腦中證實(shí)了GRK亞細(xì)胞位置的晚期改變［20］。

2.1 GRK2功能紊亂與AD 早期已有實(shí)驗(yàn)詳細(xì)描述了AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GRK2的變化［19］。它包括兩方面:胞膜上GRK2濃度的中度下降和胞質(zhì)中GRK2濃度的顯著提高。之后的研究又證實(shí)了AD患者大腦樣本中GRK2過度表達(dá)，且沉積在損傷的線粒體和NFTs［21-22］。有趣的是，AD患者外周血樣本中的GRK2總體水平不僅高于對(duì)照組，且與認(rèn)知水平負(fù)相關(guān)［23］。在 GRK2缺失小鼠模型中，GRK2缺失后通過影響β腎上腺素受體脫敏，造成不可補(bǔ)償?shù)娜毕?，而這一結(jié)果僅限于心血管系統(tǒng)［6］。也就是說，由AD患者胞膜上GRK2濃度的適度下降引起的一些病理改變可能僅限于心血管系統(tǒng)。由于GRK2在組織中廣泛存在和表達(dá)，對(duì)由GRK2總濃度升高產(chǎn)生的潛在影響，可能不只在腦血管方面，還包括線粒體損傷和NFTs。但事實(shí)上，在GRK2轉(zhuǎn)基因小鼠中GRK2只在心血管系統(tǒng)中過度表達(dá)［24］，這也為確認(rèn)GRK2在心血管系統(tǒng)中的作用提供了依據(jù)。

這些體內(nèi)體外研究結(jié)果提示GRK2的過度表達(dá)是一個(gè)早期事件，發(fā)生在AD的前驅(qū)階段，這一階段的損傷是可逆的。到目前為止，相關(guān)研究還停留在GRK2功能紊亂和AD關(guān)聯(lián)性的研究上。AD患者同時(shí)存在神經(jīng)損傷和血管并發(fā)癥，這一發(fā)病機(jī)制是否與GRK2功能紊亂有關(guān)?對(duì)此的認(rèn)識(shí)還限于對(duì)心腦關(guān)聯(lián)的理解上［25］。

2.2 GRK5功能紊亂與AD AD轉(zhuǎn)基因小鼠的GRK5變化同樣包括胞膜上GRK5濃度的下降和胞質(zhì)中 GRK5濃度的上升，但總體水平改變不明顯［19］。同GRK2轉(zhuǎn)基因小鼠相似，GRK5轉(zhuǎn)基因小鼠的基因也加有心臟特殊啟動(dòng)子，不適合用于研究非心血管組織中GRK5過度表達(dá)的影響。然而，體外研究的最新成果報(bào)道GRK5的RH區(qū)通過激酶依賴的機(jī)制抑制了核因子NF-κB，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的凋亡［11-12］。如果這種影響在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也存在，那么胞漿中GRK5濃度的提高同樣可以促使神經(jīng)細(xì)胞的退化。

2.2.1 胞膜上GRK5的缺失在AD發(fā)病機(jī)制中的作用 為了執(zhí)行在GRCP脫敏中的主要功能，GRKs要么如GRK5預(yù)先位于胞膜上，要么添補(bǔ)到胞膜上。特別在發(fā)現(xiàn)GRK5某些與激酶無關(guān)的功能之前，使GRCP脫敏被認(rèn)為是GRK5的全部功能。GRK5缺失特指GRK5在胞膜上和功能上的缺失，而不是全體GRK5的下調(diào)。

2.2.2 導(dǎo)致GRK5缺失的因素 GRK5的亞細(xì)胞位置由促胞膜結(jié)合因素和促胞質(zhì)結(jié)合因素之間的平衡來調(diào)節(jié)。與AD或衰老相關(guān)的因素打破這一調(diào)節(jié)平衡導(dǎo)致胞膜GRK5缺乏。低劑量的可溶性Aβ就是其中因素之一［19］，它與 AD關(guān)系密切。除此之外，谷氨酸、高同型半胱氨酸以及氧化應(yīng)激都可以引起胞膜GRK5缺失。事實(shí)上雖然總體GRK5隨著年齡的增長(zhǎng)是上調(diào)的，但與年輕小鼠相比，衰老小鼠的胞膜GRK5仍顯著缺乏。通過這些初步觀察結(jié)果可以推測(cè):胞膜GRK5缺乏可能與正常衰老中的基因變異有關(guān)，而在AD中GRK5缺失則更為嚴(yán)重。

2.2.3 GRK5缺乏在病理上的影響 關(guān)于這方面的證據(jù)主要是從GRK5缺乏的小鼠模型如GRK5KO小鼠和GRK5KO/APPsw小鼠中得到的。可以預(yù)料的是，GRK5KO小鼠可以產(chǎn)生一種編碼第1-178氨基酸的轉(zhuǎn)錄物，這種轉(zhuǎn)錄物覆蓋了RH區(qū)的第50-176氨基酸［8］。這就意味著GRK5KO小鼠只是在GRK5中缺乏依賴激酶活性的功能形式，依賴于GRK5的RH區(qū)或不依賴于激酶的區(qū)域卻沒有改變。另外，與其他AD小鼠模型相比，基因修改還沒有發(fā)生在與AD相關(guān)的基因如β-淀粉狀蛋白前體蛋白(βAPP)、早老蛋白、tau蛋白、載脂蛋白E等。因此，這些小鼠的表型僅僅由GRK5活性的喪失或缺乏導(dǎo)致的。

給予非選擇性毒蕈堿激動(dòng)劑的年輕大鼠展現(xiàn)出輕度自發(fā)性低體溫和顯著的行為超敏［8］，老年對(duì)照組則展示了明顯的短時(shí)程工作記憶短缺和低敏感性［26］。遺忘型輕度認(rèn)知障礙或多或少參與病理改變水平的調(diào)節(jié)，這種病理改變包括軸突缺陷，突觸蛋白及毒蕈堿受體下降，海馬可溶性Aβ和tau蛋白水平上升。突觸素水平是突觸退化的權(quán)威性標(biāo)志物，但在雌雄混合老鼠中并未顯著改變，但之后只在GRK5KO雌鼠中發(fā)現(xiàn)突觸素水平明顯下降［27］。除了在電子顯微鏡中觀察到的微量類似Aβ的纖維狀結(jié)構(gòu)和被活性星形膠質(zhì)包裹的退化軸突成分，沒有發(fā)現(xiàn)任何SPs或炎性反應(yīng)的改變。分級(jí)辨別函數(shù)分析得出不同基因型組別之間的區(qū)別很明顯，這支持了GRK5存在顯著的基因劑量效應(yīng)。因此，單獨(dú)GRK5缺乏可以導(dǎo)致遺忘型輕度認(rèn)知障礙的發(fā)生，加速了衰老過程中與AD相關(guān)的病理進(jìn)程。

GRK5缺乏最初被發(fā)現(xiàn)選擇性損傷毒蕈堿受體脫敏［8］，近期有研究證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)并一步論述了這種選擇性主要針對(duì)毒蕈堿受體中全部M2、部分M4，但不包括 M1［28］。眾所周知，M1、M2、M4 在海馬中含量豐富。M2/M4作為主要的突觸前受體，負(fù)性調(diào)節(jié)著海馬記憶回路中乙酰膽堿的釋放［29］。GRK5缺乏在病理方面的潛在影響可能是雙重的:(1)它直接引起突觸前M2/M4自身受體信號(hào)的延長(zhǎng)或者突觸前膽堿能過度活躍;(2)突出前膽堿能過度活躍反過來導(dǎo)致海馬記憶回路中ACh釋放減少，使得包括突觸后M1在內(nèi)的突觸后膽堿能活動(dòng)減退。對(duì)于這一點(diǎn)，已有研究證實(shí)了GRK5缺乏導(dǎo)致了 ACh 釋放減少［28］。

對(duì)GRK5缺陷的APPsw老年小鼠的最初研究發(fā)現(xiàn):相對(duì)于APPsw小鼠，GRK5KO缺陷的APPsw小鼠的大腦發(fā)生了非常嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，包括微球蛋白和星形膠質(zhì)蛋白的形成［30］。GRK5KO小鼠大腦中未發(fā)現(xiàn)任何炎癥性反應(yīng)，但與APPsw小鼠雜交后，卻表現(xiàn)出比 APPsw小鼠更為嚴(yán)重的炎癥性反應(yīng)。這種嚴(yán)重的炎癥性反應(yīng)是GRK5缺陷和APPsw過度表達(dá)協(xié)同作用的結(jié)果。另外有研究還發(fā)現(xiàn)在GRK5KO老鼠中可溶性 Aβ濃度有了中度的增長(zhǎng)［26］。GRK5缺失可能會(huì)促進(jìn)GRK5缺陷的APPsw小鼠的Aβ積聚，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥性反應(yīng)。

2.2.4 GRK5缺乏和現(xiàn)存AD發(fā)病機(jī)制假說的關(guān)系

關(guān)于AD的致病因素和發(fā)病過程的討論由來已久，在眾多假設(shè)當(dāng)中，膽堿能損傷假說和Aβ毒性假說是其中廣為接受的兩種，它們極大促進(jìn)了AD藥物學(xué)研究的發(fā)展［31］。前者認(rèn)為，中樞膽堿能神經(jīng)功能障礙在很大程度上是AD認(rèn)知功能下降的主要原因;后者則提出AD的中樞致病分子是Aβ。隨著對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的逐漸深入了解，關(guān)于假說細(xì)節(jié)的描述得到不斷完善，這使得這些假說的地位更加牢固［31-34］。關(guān)于GRK5缺失的研究可能會(huì)成為兩種假說聯(lián)系的橋梁。一方面，Aβ是GRK5缺乏的主要誘導(dǎo)因素之一;另一方面，GRK5的缺乏選擇性地使膽堿能功能受到損傷。已有研究［35-36］顯示膽堿能異常，特別是突觸后膽堿能活動(dòng)減退，通過β淀粉生成途徑影響APP過程，最終促進(jìn)了Aβ生成。這些過程形成一個(gè)惡性循環(huán)，導(dǎo)致Aβ的積聚和膽堿能異常，加速了AD的病理進(jìn)程。

3 結(jié)論與展望

GRKs功能紊亂不僅與AD大部分病理過程具有緊密的相關(guān)性，并且是導(dǎo)致Aβ積聚與膽堿能功能障礙之間惡性循環(huán)的主因之一。展望GRKs理論的未來，由于上述原因的存在，使得其具備成為一個(gè)理想的AD等神經(jīng)退行性疾病的有效預(yù)防和治療靶點(diǎn)的強(qiáng)大可能性。

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