鰱魚內(nèi)臟油提取方法的比較研究

王海磊，羅慶華，*，黃美娥，王苗苗，吳沛霖，向建國

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南張家界427000；2.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南長沙410208；3.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南長沙410128）

鰱魚（Hypophthalmichehys molitrix）是我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一，鰱魚以浮游動植物為食，食物鏈短，是水環(huán)境中能量轉(zhuǎn)化效率最高的魚類之一。鰱魚生長快，天然產(chǎn)量高，價格便宜，分布廣泛，我國各大水系隨處可見[1]。鰱魚腹腔內(nèi)含有大量脂肪，與其他淡水魚相比，其脂肪中含有較高的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等多烯酸，n-3族多烯酸總含量達到34.9%，ω-3與ω-6的比值約為1.7，遠高于其他淡水魚，與海水魚相近[2]。研究從鰱魚加工廢棄物—內(nèi)臟中提取魚油，變廢為寶，具有重要的經(jīng)濟效益與生態(tài)效益。

目前，魚油的提取方法主要有壓榨法[3]、有機溶劑法[4]、蒸煮法[5]、淡堿水解法[6]、酶解法[7]和超臨界流體萃取法[8]等，經(jīng)過改進的淡堿水解法—鉀法，提取液中含有鉀鹽，可以進一步生產(chǎn)為鉀肥，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[9]。酶解法提取魚油的工藝條件溫和，提取率高，魚油質(zhì)量好，同時酶解液中還含有豐富的小分子肽和氨基酸等，可以進一步加以利用[10]。本研究以鰱魚內(nèi)臟為原料，采用鉀法和酶解法進行魚油提取工藝條件對比研究，并結(jié)合魚油理化分析指標(biāo)，獲得最佳魚油提取方法與工藝條件，以期為鰱魚及其他淡水魚內(nèi)臟的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚 秋季購自湖南省張家界市永定區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，2～3齡，體重1.5～3.0kg；先將其內(nèi)臟去除膽囊、鰾及腸道內(nèi)消化物，清洗瀝干，用絞肉機絞碎，-20℃冷凍儲藏備用；石油醚（30～60℃）、氫氧化鉀、硝酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、冰乙酸、異辛烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、環(huán)己烷、淀粉、韋氏試劑、正己烷 均為分析純；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 均為食品級，20萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司。

HH-系列恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；JA2003N型分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；HM-20S型pH計日本東亞電波工業(yè)株式會社；LD5-2A型離心機 北京醫(yī)用離心機廠；

1.2 實驗方法

1.2.1 鰱魚內(nèi)臟粗脂肪含量測定 索氏抽提法，參照GB/T 5009.6-2003。

1.2.2 魚油提取率的計算 魚油提取率（%）=魚油質(zhì)量/原料中的脂肪質(zhì)量×100。

1.2.3 鉀法提取魚油工藝 稱取20g（精確至0.001g）樣品于250m L錐形瓶中，按液固比1.5∶1（m L/g）加水，用20%氫氧化鉀溶液調(diào)pH后置于水浴中，攪拌加熱到一定溫度，保溫一定時間，加入一定量的硝酸鉀，繼續(xù)攪拌保溫一定時間，然后在4500r/min下離心15m in，分離出上層油脂，得粗魚油提取率。

1.2.3.1 不同pH對魚油提取率的影響 分別調(diào)pH 6、7、8、9、10后，于70℃、水解40m in，再加入4%KNO3，鹽析20min，提取魚油進行分析。

1.2.3.2 不同水解溫度對魚油提取率的影響 調(diào)整pH為8后，分別于50、60、70、80、90℃，水解40m in，再加入4%KNO3，鹽析20m in，提取魚油進行分析。

1.2.3.3 不同水解時間對魚油提取率的影響 調(diào)整pH為8，于70℃，分別水解30、40、50、60、70m in后，再加入4%KNO3，鹽析20m in，提取魚油進行分析。

1.2.3.4 不同鹽用量對對魚油提取率的影響 調(diào)整pH為8，于70℃，水解40min后，再分別加入2%、3%、4%、5%、6%KNO3，鹽析20m in，提取魚油進行分析。

1.2.3.5 不同鹽析時間對魚油提取率的影響 調(diào)整pH為8，于70℃，水解40m in后，加入5%KNO3，再分別鹽析10、20、30、40、50m in，提取魚油進行分析。

1.2.3.6 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，在液固比1.5∶1、KNO3用量5%的條件下，選擇溫度、pH、水解時間、鹽析時間4個因素作為正交實驗因素，以魚油的提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交實驗設(shè)計，因素水平見表1。

表1 鉀法提取魚油的正交實驗因素及水平表Table1 Factors and levels of potassium hyelroxide hydrolysis of orthogonal test

1.2.4 酶解法提取魚油工藝 稱取20g（精確至0.001g）樣品置于250m L錐形瓶中，按液固比1∶1加水后調(diào)節(jié)pH至蛋白酶最適值，然后加入一定量的蛋白酶，于一定溫度條件下保溫水解一定時間。酶解完成后，倒出酶解液，用適量水沖洗錐形瓶，溶液并入酶解液，酶解液在4500r/m in下離心15m in，分離出上層油脂，得粗魚油。

1.2.4.1 酶的篩選 在酶添加量2%，液固比為1∶1，在各種酶的最適條件下酶解4h，提取魚油進行分析。

1.2.4.2 不同pH對魚油提取率的影響 調(diào)液固比1∶1，調(diào)pH 5、6、7、8、9后，加入2%木瓜蛋白酶，于50℃、酶解4h，提取魚油進行分析。

1.2.4.3 不同酶解溫度對魚油提取率的影響 調(diào)液固比1∶1、pH 7后，加入2%木瓜蛋白酶，分別于30、40、50、60、70℃條件下，酶解4h，提取魚油進行分析。

1.2.4.4 不同酶添加量對魚油提取率的影響 調(diào)液固比1∶1、pH 7后，分別加入1%、2%、3%、4%、5%木瓜蛋白酶后，于50℃條件下，酶解4h，提取魚油進行分析。

1.2.4.5 不同酶解時間對魚油提取率的影響 調(diào)液固比1∶1、pH 7后，加入2%木瓜蛋白酶后，于50℃條件下，分別酶解1、2、3、4、5h，提取魚油進行分析。

1.2.4.6 不同液固比對魚油提取率的影響 分別以液固比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1加水后，調(diào)pH7后，加入2%木瓜蛋白酶，于50℃條件下，酶解3h，提取魚油進行分析。

1.2.4.7 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，在pH為7的條件下，選擇溫度、酶解時間、酶添加量和液固比4個因素作為正交實驗因素，以魚油的提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交實驗設(shè)計，因素水平見表2。

表2 酶法提取魚油的正交實驗因素及水平表Table2 Factors and levels of enzymolysis hydrolysis orthogonal test

1.2.5 魚油的理化性質(zhì)分析 酸值：熱乙醇測定法（GB/T 5530-2005）；過氧化值：硫代硫酸鈉滴定法（GB/T 5538-2005）；碘值：硫代硫酸鈉滴定法（GB/T 5532-2008）；水分及揮發(fā)物含量測定：直接干燥法（GB/T 5528-2008）；不溶性雜質(zhì)：坩堝式過濾器法（GB/T 15688-2008）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 運用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，每個實驗重復(fù)三次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量

測得鰱魚內(nèi)臟的脂肪含量為36.21%，比相關(guān)報道[11]的含量高，這可能與鰱魚的飼養(yǎng)方式和取魚季節(jié)有關(guān)。

2.2 鉀法提取鰱魚內(nèi)臟魚油

2.2.1 pH對提取率的影響 由圖1可知，隨著pH的升高，魚油提取率先增加后減小，pH為8時魚油的提取率最高。

圖1 pH對魚油提取率的影響Fig.1 Effectof pH on the extraction rate of fish oil

2.2.2 水解溫度對提取率的影響 由圖2可知，隨著提取溫度的升高，魚油提取率先增大后減小，70℃時魚油的提取率最高。

圖2 溫度對魚油提取率的影響Fig.2 Effectof temperature on the extraction rate of fish oil

2.2.3 水解時間對提取率的影響 由圖3可知，在40min之前，魚油提取率隨著水解時間的延長而急劇增大，40m in之后，提取率略有增大，隨著時間的延長，魚油的氧化程度較深，品質(zhì)下降。因此最適水解時間為40m in。

2.2.4 鹽用量對提取率的影響 由圖4可知，魚油提取率隨著硝酸鉀用量的增加，先增加后減小，當(dāng)KNO3用量為5%時提取率達到最大。

圖3 水解時間對魚油提取率的影響Fig.3 Effectof hydrolysis time on the extraction rate of fish oil

圖4 硝酸鉀用量對魚油提取率的影響Fig.4 Effectof potassium nitrate amounton the extraction rate of fish oil

2.2.5 鹽析時間對提取率的影響 由圖5可知，魚油提取率隨著鹽析時間的增加，先增大后減小，當(dāng)鹽析時間為20min時達最高值。

圖5 鹽析時間對魚油提取率的影響Fig.5 Effect of salting out time on the extraction rate of fish oil

2.2.6 正交實驗結(jié)果與分析 對表3中數(shù)據(jù)進行方差分析，其結(jié)果由表4可知，因素A、B較顯著，因素C顯著，因素D不顯著，因素作用的順序是B＞A＞C＞D，即pH＞水解溫度＞水解時間＞鹽析時間，與極差分析得出的結(jié)果一致。分析得出鉀法提取鰱魚內(nèi)臟魚油的最佳工藝條件為A2B1C2D1，即液固比1.5∶1、硝酸鉀用量5%、溫度70℃、pH 7.5、水解時間40m in和鹽析時間15min。驗證實驗結(jié)果為87.49%，高于正交實驗表中其他組合結(jié)果，表明該條件下魚油提取率最高。

表3 正交實驗結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal test

表4 正交實驗結(jié)果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal test

2.3 酶解法提取鰱魚內(nèi)臟油

2.3.1 酶的篩選 由表5可知，木瓜蛋白酶的提取率最高。這可能與蛋白酶的酶切位點及對肽鍵的專一性不同有關(guān)。采用木瓜蛋白酶進行魚油的提取。

表5 不同種類的酶對魚油提取率的影響Table5 Effectof enzyme on the extraction rate of fish oil

2.3.2 pH對提取率的影響 由圖6可知，魚油提取率隨著pH的升高，先增大后減小，當(dāng)pH為7時魚油提取率最高。各種蛋白酶在具有特定的最適pH，過高或過低的pH都會影響酶的活力。

2.3.3 酶解溫度對提取率的影響 由圖7可知，魚油提取率隨酶解溫度的升高，先增大后減小，溫度為50℃時，魚油提取率最高。

2.3.4 酶添加量對提取率的影響 由圖8可知，隨著酶添加量的增大，魚油提取率先增大后減小，酶適宜添加量為2%。

圖6 pH對魚油提取率的影響Fig.6 Effect of pH value on the extraction rate of fish oil

圖7 酶解溫度對魚油提取率的影響Fig.7 Effectof enzymolysis temperature on the extraction rate of fish oil

圖8 酶添加量對魚油提取率的影響Fig.8 Effectof enzyme dosage on the extraction rate of fish oil

圖9 酶解時間對魚油提取率的影響Fig.9 Effectof enzymolysis time on the extraction rate of fish oil

2.3.5 酶解時間對提取率的影響 由圖9可知，在3h之前，魚油提取率隨著時間的增加急劇上升，當(dāng)時間超過3h后，提取率稍有增大。但考慮到隨著時間的延長，魚油的氧化程度加深，品質(zhì)下降。因此最佳酶解時間為3h。

2.3.6 液固比對魚油提取率的影響 由圖10可知，隨著液固比的增加，魚油提取率先增加后減小，當(dāng)液固比為2∶1時，魚油提取率達到最大值。

圖10 液固比對魚油提取率的影響Fig.1 0 Effectofwater-to-material ratio on the extraction rate of fish oil

表6 正交實驗結(jié)果與分析Table6 Results and analysis of orthogonal test

2.3.7 正交實驗結(jié)果與分析 對表6中數(shù)據(jù)進行方差分析，其結(jié)果見表7，可見，因素A、C、D顯著，因素B不顯著，因素作用的主次順序是A＞D＞C＞B，即酶解溫度＞液固比＞酶添加量＞酶解時間，與極差分析結(jié)果一致。由k值顯示，最優(yōu)組合條件為A2B3C1D1。由于因素B（酶解時間）影響不顯著，為了節(jié)省時間，并減少由于酶解時間的延長而導(dǎo)致魚油氧化程度加深，確定酶解法的最佳工藝條件為A2B1C1D1，即溫度50℃、酶解時間2.5h、酶添加量1.5%和液固比1.5∶1。驗證實驗結(jié)果為90.33%，高于正交實驗表中其他組合的結(jié)果，表明該條件下魚油提取率最高。

表7 正交實驗結(jié)果方差分析Table7 Variance analysis of orthogonal test

2.4 魚油的理化性質(zhì)分析

粗魚油理化性質(zhì)分析結(jié)果見表8。可見，兩種方法提取的魚油均達到粗魚油二級標(biāo)準(zhǔn)，其中過氧化值均達到粗魚油一級標(biāo)準(zhǔn)。酶解法提取的魚油品質(zhì)稍好。這可能與提取溫度有關(guān)，因酶解法比鉀法提取溫度低，操作條件溫和，魚油氧化程度低。但粗魚油因含有水分、磷脂、粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、游離脂肪酸和色素等雜質(zhì)，其品質(zhì)較差且不穩(wěn)定，需要經(jīng)過進一步的精制，提高魚油的品質(zhì)。

3 結(jié)論

3.1 鰱魚內(nèi)臟脂肪含量高，為36.21%，魚油提取率高，鉀法與酶解法的提取率分別達87.49%與90.33%，故其為魚油提取的良好材料。利用鰱魚內(nèi)臟生產(chǎn)魚油可以突破深海魚油原料的局限，并能提高鰱魚的產(chǎn)品附加值和資源利用率，同時可避免環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)效益。

3.2 鉀法提取鰱魚內(nèi)臟油的最佳工藝條件為液固比1.5∶1、硝酸鉀用量5%、溫度70℃、pH 7.5、水解時間40m in和鹽析時間15m in，魚油提取率為87.49%。酶解法提取鰱魚內(nèi)臟油的最佳工藝條件為pH 7、溫度50℃、酶解時間2.5h、酶添加量1.5%和液固比1.5∶1，魚油提取率為90.33%。酶解法的提取率高于鉀法，且提取的魚油品質(zhì)稍好于鉀法，酶解法是鰱魚油提取的較好方法。

表8 粗魚油的理化性質(zhì)Table8 Physics and chemistry indexes of crude fish oil

3.3 兩種方法最佳工藝條件下提取的魚油均達到粗魚油的二級標(biāo)準(zhǔn)，其中過氧化值均達到粗魚油一級標(biāo)準(zhǔn)。需進行精制以達到食用的目的。

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