耐受高體積分?jǐn)?shù)丁醇乳酸菌的篩選及其鑒定

劉洪儒，曹龍奎,,*，孫大慶，宋 亮，楊春宇

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

耐受高體積分?jǐn)?shù)丁醇乳酸菌的篩選及其鑒定

劉洪儒1，曹龍奎1,2,*，孫大慶2，宋 亮1，楊春宇1

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

從不同樣品中分離和篩選在較高丁醇體積分?jǐn)?shù)下生長的菌株，通過不斷提高培養(yǎng)基中的丁醇添加量測定菌株的相對生長率，經(jīng)過初測和復(fù)測，選擇相對生長率較高的菌株繪制其耐受曲線，分析其能夠耐受丁醇的體積分?jǐn)?shù)。對菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，結(jié)合菌體形態(tài)及菌落特征確立菌株的種屬。篩選得到2株耐受丁醇的體積分?jǐn)?shù)均達(dá)到了3%的菌株，分別為A37和A50。經(jīng)鑒定，序列分析與生理生化實驗結(jié)果是一致的，A37為Enterococcus faecalis，A50為Lactobacillus fermentum。結(jié)果表明兩株菌具有較高的丁醇耐受性。

乳酸菌；丁醇耐受性；相對生長率；篩選；鑒定

丁醇除了作為重要的有機(jī)化工原料外，還是一種極具潛力的可再生的生物液體燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)，具有低親水性以及不易揮發(fā)等特點[1-2]。隨著石油化工生產(chǎn)丁醇成本的增長以及其造成的環(huán)境污染問題，使得生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇成為新的研究熱點[3]。進(jìn)行丁醇發(fā)酵的微生物主要是梭狀芽孢桿菌Clostridium acetobutylicum、C.beijerinckii、C.saccharoperbutylacetonicum和C.saccharobutylicum[4-5]。然而，由于丁醇對細(xì)胞的毒性，導(dǎo)致在發(fā)酵中其產(chǎn)丁醇或者耐受丁醇的體積分?jǐn)?shù)均無法超過20g/L[6-8]。在很大程度上制約了丁醇發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，而且梭菌(Clostridium)從產(chǎn)酸過程到產(chǎn)溶劑過程的過渡中，多復(fù)合因子對該細(xì)胞代謝過程進(jìn)行著復(fù)雜的調(diào)節(jié)和控制，不管是通過菌株突變還是通過代謝工程改造的途徑獲得發(fā)酵高產(chǎn)的梭菌菌株都是非常困難的[9-11]。因此有必要尋找新的菌株和進(jìn)行新的發(fā)酵丁醇生產(chǎn)途徑的研究。

目前梭菌的丁醇合成及代謝網(wǎng)絡(luò)的研究比較清晰[12]，通過構(gòu)建其他菌株表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)梭菌丁醇合成基因的研究已經(jīng)獲得成功[13-15]。但由于這些菌株本身對丁醇的耐受性不高并沒有明顯提高丁醇產(chǎn)量，因而尋找耐受高體積分?jǐn)?shù)丁醇微生物是丁醇異源重組生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。在篩選能夠耐受丁醇微生物的研究中，Knoshaug等[16]通過比較24種微生物對丁醇的耐受性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株耐丁醇的體積分?jǐn)?shù)在1%～2%之間，幾株酵母菌可以耐丁醇體積分?jǐn)?shù)為2%，只有兩株乳酸菌能耐丁醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%，說明各種微生物對丁醇的耐受性是不盡相同的。Li等[17]篩選得到能夠在丁醇體積分?jǐn)?shù)為2.5%的培養(yǎng)基中生長的Enterococcus faecium，丁醇體積分?jǐn)?shù)為3%時生長的Lactobacillus plantarum E4，說明乳酸菌可能具有固有的丁醇耐受性。左文樸等[18]得到能夠耐受丁醇體積分?jǐn)?shù)為25g/L的菌株Lactobacillusm ucosae btpz-4-1和Pediococcus pentosaceus btpz-6-3。

本實驗通過自然篩選，從20個樣品中分離能夠耐受高體積分?jǐn)?shù)丁醇的菌株，得到兩株耐受丁醇的體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到3%的菌株，并對其進(jìn)行鑒定，確定種屬，為利用這些高耐受菌株構(gòu)建新的丁醇生產(chǎn)途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

正常人的糞便、果園新鮮及腐爛水果、水果土壤、腌制蔬菜等可能富含乳酸菌的樣本，實驗室4℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏4.0、葡萄糖20.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸二銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·H2O 0.05，吐溫-80 1.0mL，pH 6.2；MRS固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂；篩選培養(yǎng)基Ⅰ：在MRS液體培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)3%的正丁醇；篩選培養(yǎng)基Ⅱ：在MRS固體培養(yǎng)基中添加3%正丁醇。

1.3 試劑與儀器

正丁醇(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；細(xì)菌DNA提取試劑盒K713、PCR反應(yīng)試劑盒 上海英濰捷基生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶 日本TaKaRa公司。

PTC-200型PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；UVP-8000凝膠成像系統(tǒng) 美國Ultra-Violet公司；Thermo酶標(biāo)儀 美國熱電公司；BH-2光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司。

1.4 篩選方法

1.4.1 分離及純化

將采集的各種樣品用生理鹽水打散后，取上清液2%接入篩選培養(yǎng)基Ⅰ中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h。將能夠生長的樣品管中的菌液進(jìn)行梯度稀釋在MRS固體培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基Ⅱ上涂布，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48h，獲得單菌落。采用平板劃線法純化，并將純化的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后加適量甘油保藏。

1.4.2 耐受丁醇菌株的篩選

菌株2%接種量37℃活化培養(yǎng)24h，確定此時菌液的OD600nm值。2%轉(zhuǎn)接含有體積分?jǐn)?shù)為1%丁醇的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，取200μL菌液加入96孔板中用酶標(biāo)儀測得OD600nm值，計算其相對生長率，選取相對生長率較高的菌株進(jìn)行下一步實驗，同樣步驟測定在含有體積分?jǐn)?shù)為2%和3%丁醇的液體培養(yǎng)基中的相對生長率。不接種的培養(yǎng)基作為空白對照，所有實驗重復(fù)3次。相對生長率[18]為在含有丁醇的培養(yǎng)基中的OD600nm值與不加丁醇的培養(yǎng)基中的OD600nm值的比值。

1.4.3 菌株耐受丁醇曲線測定

為了防止丁醇揮發(fā)，在帶橡皮膠塞的三角瓶中進(jìn)行菌株耐受丁醇培養(yǎng)和耐受曲線測定。在MRS液體培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)的丁醇，分別為0、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.25%、3.5%，取過夜培養(yǎng)的菌液以2%的接種量接至含有各個不同體積分?jǐn)?shù)丁醇的培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，通過測定OD600nm值來檢測菌株的生長情況。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

將篩選得到的耐受丁醇體積分?jǐn)?shù)較高的菌株分別接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色，莢膜染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.2 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《乳酸細(xì)菌分離鑒定及實驗方法》[19]，對菌株進(jìn)行生理生化實驗。

1.5.3 菌株16S rDNA序列的測定與分析

1.5.3.1 基因組DNA的提取

經(jīng)傳代培養(yǎng)15h的菌液用K713細(xì)菌試劑盒提取DNA，用化學(xué)裂解法[20]提取菌株的基因組DNA。

1.5.3.2 16S rDNA的擴(kuò)增

采用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA基因。引物序列為27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

反應(yīng)體系：取DNA模板1μL，5×PCR緩沖液10μL，引物1μL，dNTPs 4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，加超純水補(bǔ)至總反應(yīng)體積為50μL。循環(huán)參數(shù)：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)；72℃延伸2min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀測結(jié)果。

1.5.3.3 16S rDNA序列測定及同源性分析

16S rDNA測序由上海英俊生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，將測定的16S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索，與已有的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。從GenBank中選擇近緣菌株的16S rDNA基因序列，應(yīng)用MEGA4.1和ClustalX軟件，采用 Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行 Bootstrap分析，重復(fù)次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化結(jié)果

采集的樣品中只有處理后的正常人的糞便能在篩選培養(yǎng)基Ⅱ中生長，獲得了461個能在丁醇體積分?jǐn)?shù)為3%的培養(yǎng)基中生長的單菌落，初步認(rèn)為其具有丁醇耐受性，具體結(jié)果見表1。

表1 在篩選培養(yǎng)基Ⅱ中分離純化得到的菌株數(shù)及其編號Table1 Strains purified in the screening medium and corresponding number

2.2 耐受丁醇菌株篩選結(jié)果

將得到的461個單菌落進(jìn)行復(fù)篩，得到22株在含有丁醇體積分?jǐn)?shù)為1%的液體培養(yǎng)基中的相對生長率大于60%，在丁醇體積分?jǐn)?shù)為2%的培養(yǎng)基中相對生長率大于30%的菌株。22株菌的具體數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。在菌株篩選的過程中，22株菌在含有丁醇體積分?jǐn)?shù)為1%、2%的培養(yǎng)基中相對生長率均較高，基本處于同一水平，并且實驗重復(fù)性良好；當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高到3%時，只有A37和A50能夠較好生長且相對生長率達(dá)到10%以上，比其他的菌株相對生長率都要高。對比Li等[17]研究中報道的耐受3%丁醇菌株的相對生長率，故選擇A37和A50作為耐受丁醇菌株繼續(xù)研究。

2.3 耐受丁醇菌株在含不同體積分?jǐn)?shù)丁醇培養(yǎng)基中的生長曲線

在37℃條件下，菌株A37和A50在12h內(nèi)的丁醇耐受情況如圖1所示。可以看出，當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)為2%以下時，菌株都能夠非常良好的生長，當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時，菌株的生長受到一定程度的抑制，但是依然能夠有一定的生長，當(dāng)丁醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%以上時，A37菌株的生長基本受到明顯的抑制。A50在丁醇體積分?jǐn)?shù)為3.25%時還有一定的生長，但在3.5%是基本陷于停滯，這表明，菌株A37和A50都能夠耐受3%的丁醇。

圖1 37℃、培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)丁醇時對A37(A)和A50(B)菌株的生長曲線Fig.1Growth curves of the isolated tolerant strains A37 (A) and A50 (B) in medium containing butanol with various concentrations at 37 ℃

2.4 耐受丁醇菌株的鑒定

2.4.1 菌株A37和A50的菌落和形態(tài)特征觀察

菌株A37在MRS培養(yǎng)基上生長成卵圓形，凸起、表面光滑、全緣、乳白色，直徑約為0.5～1.0mm； A50在MRS培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形或不規(guī)則，扁平、表面光滑、透明，直徑約為0.5～1.0mm。經(jīng)革蘭氏染色后用顯微鏡油鏡觀察，見圖2，A37菌體形態(tài)為球狀，單獨、成對或短鏈排列，革蘭氏染色呈陽性，無莢膜，無芽孢，不形成孢子。A50菌體為短桿狀，單個排列，有時成對或成鏈，形態(tài)微小，革蘭氏染色呈陽性，無芽孢。初步判定兩株菌為乳酸菌，A37為球菌，A50為桿菌。

表2 菌株在含不同丁醇體積分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基中的相對生長率(x±s, n=3)Table2 Relative growth rates of the strains in medium containing butanol at various concentrations(x±s, n=3)

表3 菌株A37和A50的生理生化特征Table3 Physiological-biochemical properties of the strain A37 and A50

表4 菌株A37和A50的糖發(fā)酵實驗結(jié)果Table4 Sugar fermentation results of strains A37 and A50

圖2 菌株A37(a)和A50(b)的顯微鏡照片(10×100)Fig.2 The images of A37 (a) and A50 (b) strain examined by microscope (10×100)

2.4.2 菌株A37和A50的生理生化及糖發(fā)酵實驗

根據(jù)鏡檢結(jié)果先確定其在乳酸菌中屬的地位，結(jié)果見表3，然后再根據(jù)屬內(nèi)種間的主要特征進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表4。通過各種生理生化實驗，再結(jié)合各菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性分析，將A37鑒定為糞腸球菌，A50為發(fā)酵乳桿菌。

2.4.3 菌株16S rDNA鑒定及進(jìn)化樹分析

圖3 菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplified products of 16S rDNA gene from the strains

由圖3可知，測序結(jié)果表明擴(kuò)增菌株的16S rDNA序列全長A37為1446bp，A50為1462bp。在1500bp左右處出現(xiàn)亮帶，無其他雜帶。

BLAST與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，結(jié)果A37與糞腸球菌屬Enterococcus faecalis(AB154827)的序列相似性為99%。A50與發(fā)酵乳桿菌屬Lactobacillus fermentum (JF812168)的序列相似性為99%。將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，得到登錄號分別為JF903802和JF903803，根據(jù)1.5.3.3節(jié)的方法進(jìn)行鑒定，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果表明，菌株A37與Enterococcus faecalis聚在同一分支，1000次 Bootstrap分析完全支持該分支，同源性達(dá)100%，與其他種的發(fā)育關(guān)系相對較遠(yuǎn)。菌株A50在系統(tǒng)發(fā)育地位上Lactobacillus fermentum在同一分支，與其相鄰菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合菌落特征和生理生化鑒定結(jié)果將菌株A37鑒定為糞腸球菌，A50鑒定為發(fā)酵乳桿菌。

圖4 菌株A37(A)和A50(B) 的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenentic tree of strain A37 (A) and A50 (B) based on the 16S rDNA gene sequences

3 討 論

采用有一定生長壓力的平板法從采集樣品中分離，限制了很多細(xì)菌的生長，減輕篩選的工作量。同時結(jié)合Li等[17]建立的以測定菌株的相對生長率為指標(biāo)對其進(jìn)行篩選，利用酶標(biāo)儀96孔板檢測菌株的OD600nm值，提高了篩選的效率，得到較理想的目的菌株，而且本研究中得到的耐受3%丁醇的菌株比左文樸等[18]篩選得到的菌株的耐受體積分?jǐn)?shù)高，基本達(dá)到研究中報道的耐受水平，但已報道的可以耐受3%丁醇的菌種中未見發(fā)酵乳桿菌。

菌株A37和A50鑒定為糞腸球菌和發(fā)酵乳桿菌，屬于乳酸菌類，拓展了乳酸菌的應(yīng)用范圍。在進(jìn)行菌種分類鑒定時，僅僅根據(jù)表型特征來劃分是不可取的。在進(jìn)行常規(guī)鑒定時，有時會出現(xiàn)表型不夠穩(wěn)定、或弱反應(yīng)等現(xiàn)象，這些都直接影響了實驗結(jié)果的判斷，而且很多表型特征不同的菌株通過16S rDNA基因序列比對后，結(jié)果卻為同一種。所以，要具體鑒定某一未知菌種，在依據(jù)表型特征鑒定的同時，要結(jié)合基因型鑒定，才能夠比較準(zhǔn)確的進(jìn)行分類鑒定。

篩選得到的耐受丁醇的菌株為構(gòu)建其他耐受丁醇基因工程菌株生產(chǎn)丁醇提供了新的菌種資源，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價值。研究表明丁醇產(chǎn)量具有很大的提升空間，但對摸清其遺傳背景，通過分子生物學(xué)技術(shù)改造使其生產(chǎn)丁醇仍需進(jìn)一步研究。

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Screening and Identification of Butanol-Tolerant Lactic Acid Bacteria

LIU Hong-ru1，CAO Long-kui1,2,*，SUN Da-qing2，SONG Liang1，YANG Chun-yu1
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China；2. Agri-food Processing and Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province, Daqing 163319, China)

Bacterial strains that can grow well in the presence of butanol at high concentration were isolated and screened from different samples. Their relative growth rates in the medium with the addition of butanol were monitored. Subjected to repeated screening, the strains with higher relative growth rates were chosen to make the butanol-resistant curve. Meanwhile, the species of the selected strains were identified by physiological and biochemical experiments and 16S rDNA analysis coupled with bacterial colony characteristics. Two bacterial strains (A37 and A50) revealed the butanol tolerance up to 3%. The 16S rDNA sequence analysis exhibited the consistent results with biochemical analysis. Moreover, A37 and A50 were identified as Enterococcus faecalis and Lactobacillus fermentum.

lactic acid bacteria；butanol tolerance；relative growth rate；screening；identification

Q939.97

A

1002-6630(2013)03-0212-05

2011-10-18

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項目(YJSCX2011-265HLJ)

劉洪儒(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：liuhongru886@126.com

*通信作者：曹龍奎(1965—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：longkuicao@yahoo.com.cn