水楊酸和牛血清白蛋白的相互作用研究及共存銅離子的影響

王旭，吳淑春，王家學(xué)，鄭青，郭玉華

(1.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，杭州 310053；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

水楊酸和牛血清白蛋白的相互作用研究及共存銅離子的影響

王旭1，吳淑春1，王家學(xué)1，鄭青2，郭玉華2

(1.浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，杭州 310053；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

目的 研究銅離子對水楊酸與血清白蛋白相互作用的影響。方法 采用熒光光譜技術(shù)研究了不同溫度下水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用及銅離子對水楊酸-BSA體系的影響。結(jié)果 運用理論模型處理實驗數(shù)據(jù)，得到水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合力類型等相互作用參數(shù)。結(jié)論 銅離子存在時，不改變水楊酸對BSA內(nèi)源熒光的猝滅類型和水楊酸-BSA分子間作用的類型，但使水楊酸與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)增大。

水楊酸；牛血清白蛋白；銅離子；熒光光譜法

水楊酸是臨床常用藥物，有抗真菌和溶解角質(zhì)等多效藥理活性。常用藥物“阿司匹林”即乙酰水楊酸，在生物體內(nèi)能很快被轉(zhuǎn)化為水楊酸。血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì)，能與多種內(nèi)源或外源性物質(zhì)結(jié)合，起到存儲與轉(zhuǎn)運的作用[1]。銅是生命體中所必須的微量元素，同時作為各種金屬酶的活性中心是生物體內(nèi)載氧蛋白活性部位的基本成分[2-3]。藥物小分子與血清白蛋白之間的復(fù)合物通常是借助于分子間作用力而形成的超分子化合物，而體內(nèi)的微量金屬元素既可能與藥物小分子形成配合物，也可能影響蛋白質(zhì)-藥物超分子體系[4-5]。故從不同角度研究蛋白質(zhì)-藥物之間及其在金屬離子存在情況下的結(jié)合反應(yīng)，有助于了解藥物在體內(nèi)的運輸和分布情況，對于闡明藥物的運輸、毒性、代謝過程及了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系具有重要意義。

因牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白高度同源，已被廣泛用作蛋白質(zhì)模型化合物進行研究[6]。熒光光譜法是研究生物大分子，特別是蛋白質(zhì)與各種有機小分子、離子和無機化合物相互作用的重要手段[2,7-8]。為了深入考察銅離子對水楊酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用的影響，本實驗用熒光光譜研究銅離子對水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影響，運用理論模型處理實驗數(shù)據(jù)得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合力類型等重要相互作用參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FP-6200 型熒光分光光度計(日本Jasco公司)；Finnpipette移液器(上海雷勃分析儀器有限公司) 5～50 μL，20～200 μL；TB-85型超級恒溫器(日本Shimadzu公司)；UPWS-10T超純水器(杭州永潔達凈化科技有限公司)；AB265-S電子分析天平(瑞典METTER TOLEDO公司)。

BSA溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，以0.10 mol?L-1NaCl維持離子強度，濃度為1.0×10-4mol?L-1。水楊酸溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，濃度為1.0× 10-3mol?L-1。CuCl2溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，濃度為1.0×10-3mol?L-1。

BSA為生化試劑，購于華東醫(yī)藥集團有限公司。水楊酸、三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)、HCl(濃度為36%～8%)、NaCl(含量≥99%)、CuCl2(含量≥99%)均為分析純；實驗用水為超純水器處理的超純水。

1.2 實驗方法

BSA熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的測定：移取一定量BSA溶液于石英比色皿中，設(shè)置發(fā)射波長為280 nm，狹縫寬度為5 nm，在室溫(298 K)下繪制250～350 nm的熒光激發(fā)光譜，測得其最大激發(fā)波長為282 nm；并在其最大激發(fā)波長處設(shè)置狹縫寬度為5 nm，在室溫(298 K)下繪制300～500 nm的熒光發(fā)射光譜，得到熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長為345 nm。

不同濃度水楊酸對BSA的熒光滴定：在一系列10.0 mL比色管中，準(zhǔn)確移取2.0 mL BSA 溶液，用微量注射器加入不同體積的水楊酸溶液，加Tris-HCl溶液定容至10.0 mL，作用1 h后，在最大激發(fā)波長為282 nm處，在280～500 nm內(nèi)掃描BSA的熒光發(fā)射光譜。

銅離子存在時不同濃度水楊酸對BSA的熒光滴定：在一系列10.0 mL比色管中，準(zhǔn)確移取2.0 mL BSA溶液，用微量注射器加入200 μL的CuCl2溶液，用微量注射器加入不同體積的水楊酸溶液，加Tris-HCl溶液定容至10.0 mL，作用1 h后，在最大激發(fā)波長為282 m處，在280～500 nm內(nèi)掃描BSA的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅現(xiàn)象

蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基在一定波長的紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出熒光。因苯丙氨酸的熒光非常弱，所以熒光信號主要來自色氨酸和酪氨酸。故蛋白質(zhì)的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸殘基本身和周圍環(huán)境的變化[9]。

在無Cu2+存在的情況下，隨著水楊酸濃度的不斷增加，BSA的內(nèi)源熒光強度逐漸降低，但激發(fā)峰和發(fā)射峰的峰形基本不變，結(jié)果見圖1。Cu2+對水楊酸與牛血清白蛋白作用的熒光有協(xié)同猝滅作用，隨著水楊酸濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光降低的強度更大，但激發(fā)峰和發(fā)射峰的峰形基本不變，結(jié)果見圖2。同時，圖1和圖2在409 nm左右均出現(xiàn)了一個熒光發(fā)射峰，且發(fā)射峰的強度隨著水楊酸濃度的增加而增強，這是溶液中游離的水楊酸產(chǎn)生的[10]。

圖1 水楊酸-BSA的熒光猝滅圖a→j-水楊酸濃度依次為：0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5 mol·L-1Fig 1 Fluorescence quenching of salicylic acid-BSA a→j-the concentration of salicylic acid: 0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5 mol·L-1

圖2 水楊酸-BSA-Cu2+的熒光猝滅圖a→j-水楊酸濃度依次為：0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5 mol·L-1Fig 2 Fluorescence quenching of salicylic acid-BSA-Cu2+a→j-the concentration of salicylic acid: 0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5 mol·L-1

2.2 猝滅機制

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能是動態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅。前者是一種能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過程，不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理活性。后者則是由于發(fā)生了配合作用，通常是產(chǎn)生了不發(fā)熒光的配合物，對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生影響，并可影響其生理活性。為了判斷水楊酸引起的BSA熒光猝滅是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)淬滅，根據(jù)猝滅效率遵循的Stern-Volmer方程：

式中F0和F分別表示未加入和加入猝滅劑時的相對熒光強度，Ksv表示動態(tài)猝滅常數(shù)，Kq表示雙分子猝滅過程的速率常數(shù)，τ0為不存在猝滅劑分子時熒光分子的平均壽命(τ0=10-8s)，[Q]表示猝滅劑的濃度。作F0/F～[Q]關(guān)系圖，得到不同溫度下Ksv的值見表1。

表1 不同溫度下水楊酸與BSA的熒光猝滅常數(shù)Ksv及線性相關(guān)系數(shù)rTab 1 Quenching constants Ksv, correlation coefficient r of salicylic acid-BSA at different temperatures

由(1)式知Kq=Ksv/τ0，由表1中Ksv計算得Kq，Kq的數(shù)量級為1012，遠大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0× 1010L·mol-1·s-1[11]，且Ksv隨著溫度的升高有所減小，由此斷定不管Cu2+存在與否，水楊酸對BSA的猝滅不是由于分子間碰撞引起的動態(tài)猝滅，而是由于形成不發(fā)光復(fù)合物的靜態(tài)猝滅。

從表1中水楊酸對BSA的猝滅常數(shù)Ksv可知，Cu2+存在時，對水楊酸與牛血清白蛋白作用的熒光有協(xié)同猝滅作用，能提高水楊酸與BSA的結(jié)合能力，猝滅常數(shù)Ksv比Cu2+不存在時大，表明Cu2+對BSA的內(nèi)源熒光猝滅效應(yīng)有所增強，Cu2+可能參與了BHA-BSA形成配合物的作用過程。

表2 不同溫度下水楊酸與牛血清白蛋白配合物的離解常數(shù)KD與結(jié)合常數(shù)KLBTab 2 Dissociation costants KDand binding constants KLBof salicylic acid-BSA at different temperatures

2.3 結(jié)合常數(shù)

在靜態(tài)猝滅中，結(jié)合常數(shù)KLB與熒光強度、猝滅劑濃度之間的關(guān)系可以用 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程表示[8]：

金屬離子直接影響藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，不同金屬離子對不同藥物分子與蛋白質(zhì)結(jié)合有截然不同的兩種影響：一是對藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合有減小作用[12-13]，二是對藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合有增強作用[7-8]。一般認為，前者主要是由于金屬離子與蛋白質(zhì)的作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合的緊鄰區(qū)域構(gòu)型發(fā)生改變，從而削弱了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合；后者則主要是由于金屬離子同時與藥物和蛋白質(zhì)結(jié)合，在藥物和蛋白質(zhì)分子間形成“離子架橋(metal ionbridge)”，從而起到增強作用。Cu2+的存在使BSA與水楊酸的結(jié)合常數(shù)略有增大，屬于第2種情況。這個過程中，Cu2+的參與降低了藥物小分子的游離濃度，這樣便增強了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合力，對延長藥物作用時間、減小藥物毒性的臨床治療是有效的。

2.4 水楊酸與BSA之間作用力的推測

一般情況下，藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子間的非共價相互作用屬分子間的弱相互作用，包括氫鍵、范德華力、靜電和疏水等多種相互作用形式，當(dāng)溫度變化不大時，可將焓變視為常數(shù)。根據(jù)熱力學(xué)公式可計算藥物小分子與生物大分子結(jié)合過程的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)：

由熱力學(xué)參數(shù)可簡單判斷其結(jié)合作用類型[14]：若ΔH＞0及ΔS＞0，則主要表現(xiàn)為疏水作用；ΔH＜0及ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用；ΔH＜0及ΔS＜0主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華力。根據(jù)實驗得到不同溫度下各體系的KLB值，由此求出其結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)，見表3。

表3 不同溫度下水楊酸-BSA作用過程的熱力學(xué)參數(shù)Tab 3 Thermodynamic parameters of salicylic acid-BSA at different temperatures

由實驗結(jié)果的熱力學(xué)參數(shù)顯示，有無Cu2+存在下，水楊酸與BSA結(jié)合過程均為ΔG＜0、ΔS＞0，表明其作用過程是一個熵增加，自由能減小以靜電引力為主的自發(fā)過程。但多數(shù)情況下，有機小分子與蛋白質(zhì)的反應(yīng)是多種作用力協(xié)同作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

熒光光譜實驗表明，在水溶液中，由于水楊酸與BSA的結(jié)合而對BSA熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅作用；銅離子存在時，不改變水楊酸對BSA內(nèi)源熒光的猝滅類型，但使水楊酸與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)增大。有無Cu2+存在下，水楊酸與BSA結(jié)合過程均為ΔG＜0、ΔS＞0，表明其作用過程是一個熵增加，自由能減小以靜電引力為主的自發(fā)過程。

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Interaction of Salicylic Acid with Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Cu2+on the Reaction

WANG Xu1, WU Shuchun1, WANG Jiaxue1, ZHENG Qing2, GUO Yuhua2
(1.Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China; 2.Faculty of Life Science, Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, China)

OBJECTIVE To investigate the interactions of salicylic acid and bovine serum albumin (BSA) in the presence of Cu2+. METHODS The interaction between salicylic acid and BSA was investigated using fluorescence at different temperatures. The effect of Cu2+on the salicylic acid-BSA system was also researched. RESULTS The quenching constants, binding constants and binding force type were measured according to theory model. CONCLUSION The presence of Cu2+doesn’t change quenching type and force type between salicylic acid and BSA, but the apparent association constant(KLB) becomes higher.

salicylic acid; bovine serum albumin; Cu2+; fluorescence spectrometry

R913

A

1007-7693(2013)10-1066-05

2012-12-25

浙江省自然科學(xué)基金項目(LQ12B03001)；浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校一般研究計劃項目(2013B04)

王旭，女，博士，副教授 Tel: (0571)87692890 E-mail: wangxu.linda@163.com