頭孢丙烯微生物限度檢查方法的驗證

洪亮，盧啟寰

(臺州市食品藥品檢驗所，浙江 臺州 318000)

頭孢丙烯微生物限度檢查方法的驗證

洪亮，盧啟寰

(臺州市食品藥品檢驗所，浙江 臺州 318000)

目的 建立頭孢丙烯原料的微生物限度檢查方法，并對其進行方法學(xué)驗證。方法 按中國藥典2010年版方法對3個批號的頭孢丙烯原料進行微生物限度檢查方法驗證。細菌的計數(shù)方法和控制菌檢查均采用低速離心-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法；霉菌和酵母菌計數(shù)采用平皿法。結(jié)果 各試驗菌的回收率均＞70%，稀釋液回收率也均＞70%，控制菌檢查具有專屬性，滿足中國藥典2010年版驗證試驗的要求。結(jié)論 本品的微生物限度檢查方法有效可行，可用于頭孢丙烯原料的微生物限度檢查。

頭孢丙烯原料；微生物限度檢查；方法學(xué)驗證

頭孢丙烯(cefprozil)是第二代頭孢類抗生素，具有廣譜抗菌作用，對革蘭陽性需氧菌中的金黃色葡萄球菌(包括產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株)，肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌作用明顯，對堅忍腸球菌，大腸埃希菌，單核細胞增多性李斯特菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，Warnei葡萄球菌，無乳鏈球菌，鏈球菌C、D、F、G組和草綠色鏈球菌等具抑制作用。本品作用機制是抑制細菌細胞壁合成，使細菌迅速破裂溶解。臨床廣泛應(yīng)用于敏感菌所致上、下呼吸道感染，皮膚和皮膚軟組織感染。根據(jù)中國藥典2010年版規(guī)定，在對如抗菌消炎膠囊、清胰口服液等具有抗菌活性的藥物進行微生物限度檢查時[1-2]，應(yīng)首先消除其抗菌活性，并對所用方法進行驗證，以確定所采用的方法適用于該藥品微生物限度檢查[3]。

1 材料

1.1 儀器

萬級空氣凈化間、百級凈化臺、生物安全柜(杭州金利凈化工程有限公司)；LDZX-50FBS型電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；恒溫振蕩儀(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；DAG-9248A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，GNP-9270型恒溫培養(yǎng)箱，霉菌培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；80-2型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由浙江省食品藥品檢驗研究院提供。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：121129)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號：1201062)、改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基(批號：120113)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：120314)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：1012152)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號：120306)、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG，批號：101020)，均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：20130121，青島藍雁綠檢)，0.9%無菌氯化鈉溶液(批號：121218，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

頭孢菌素酶(批號：201205011，每支200萬單位，杭州北望生物技術(shù)有限公司)。

1.4 樣品

頭孢丙烯(浙江華方藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：130101，130102，130103，規(guī)格：原料藥)

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在30~35 ℃下培養(yǎng)18~24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，在23~28 ℃下培養(yǎng)24~48 h 后，將上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50~100 cfu的菌懸液；接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5~7 d，加入3~5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05% (mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)50~100 cfu的孢子懸液[4]。

2.2 供試液制備

稱取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，放入水浴溫度為45 ℃的恒溫振蕩儀中振蕩混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證

樣品在水中的溶解性差，并對細菌特別是金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，因此細菌計數(shù)可用培養(yǎng)基稀釋法、低速離心沉淀-薄膜過濾法、低速離心沉淀-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法分別處理，分析上述幾種方法對各菌的回收結(jié)果，選擇出各菌回收率在 70%以上的方法作為有效方法；霉菌和酵母菌計數(shù)可采用平皿法進行試驗驗證。

2.3.1 試驗組 細菌計數(shù)：①培養(yǎng)基稀釋法：取1∶10供試液1 mL，等量分注于5個平皿中，每個平皿中再分別加入試驗菌1 mL(50~100 cfu·mL-1)，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL。按大腸、金葡、枯草順序平行制備，下同。②低速離心沉淀-薄膜過濾法：取1∶10供試液10 mL注入滅菌離心管中，500 r·min-1離心3 min，取出全部上清液加至含50 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的滅菌濾器中進行薄膜過濾。接著用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行沖洗，每膜每次沖洗50 mL，振搖濾過，分別嘗試用400，600，800 mL的沖洗量來進行沖洗。在最后一次沖洗中，每膜加入試驗菌1 mL(50~100 cfu· mL-1)，過濾。取出濾膜，菌面朝上，貼于已制備好的營養(yǎng)瓊脂平皿里。③低速離心沉淀-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法：前面操作同低速離心沉淀-薄膜過濾法，也分別用400，600，800 mL的沖洗量來進行沖洗，在最后一次50 mL的沖洗中，先加20 mL沖洗液，再加入頭孢菌素酶50萬單位，在滅菌濾器中反應(yīng)10 min后，再過濾，接著每膜加入余下的30 mL沖洗液，再加入試驗菌1 mL (50~100 cfu·mL-1)，過濾。取出濾膜，菌面朝上，貼于已制備好的營養(yǎng)瓊脂平皿(每個平皿含頭孢菌素酶50萬單位)。上述幾種方法制備的營養(yǎng)瓊脂平皿于35 ℃培養(yǎng)48 h后取出計數(shù)。

霉菌和酵母菌計數(shù)平皿法：每個平皿中直接加入1∶10供試液1 mL，再分別加入白色念珠菌、黑曲霉1 mL(50~100 cfu·mL-1)，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15 mL。每種試驗菌平行制備2個平皿，置25 ℃培養(yǎng)3 d，取出計數(shù)。

2.3.2 菌液組 取各試驗菌50~100 cfu，加相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)。測定加入的菌數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 菌液組計數(shù)結(jié)果Tab 1 Results of microbial group counts

2.3.3 供試品對照組 按試驗組的方法處理，不加菌液，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)，計數(shù)，測定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1 mL供試液含50～100 cfu(其中“2.3.1”細菌計數(shù)：①培養(yǎng)基稀釋法里相應(yīng)的稀釋劑對照組最終菌濃度為每0.2 mL供試液含50～100 cfu)，按試驗組菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。

2.3.5 回收率計算 試驗組菌回收率=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%

稀釋劑對照組菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%[2]

2.3.6 菌落計數(shù)法驗證結(jié)果 上述各法各做3次平行試驗，計算回收率，取3次平行試驗稀釋劑對照組和試驗組的菌回收率均在70%以上的最簡方法為頭孢丙烯原料的菌落計數(shù)法，結(jié)果見表2?？傻贸黾毦嫈?shù)采用低速離心-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法(400 mL沖洗量)；霉菌和酵母菌計數(shù)采用平皿法。

表2 5種試驗菌方法學(xué)驗證回收率結(jié)果Tab 2 Results of the five kinds of the recovery test

2.4 控制菌檢查法的驗證

2.4.1 試驗組 ①培養(yǎng)基稀釋法：取3批藥品的1∶10供試液各10 mL及10～100 cfu試驗菌加入滅菌錐形瓶中，再分別嘗試加入300，500 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基。②低速離心沉淀-薄膜過濾法：采用“2.3.1”項下細菌計數(shù)方法②制備薄膜，放入含100 mL膽鹽乳糖滅菌瓶中。③低速離心沉淀-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法：采用“2.3.1”項下細菌計數(shù)方法。④制備薄膜，放入含100 mL膽鹽乳糖滅菌瓶中(含50萬單位頭孢菌素酶)。以上制備的薄膜置35 ℃培養(yǎng)18～24 h后做MUG試驗及靛基質(zhì)試驗。

2.4.2 控制菌驗證結(jié)果 從表3可以看出，在3個批號樣品的平行試驗中，采用低速離心沉淀-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法為最優(yōu)方法，試驗組檢出大腸埃希菌，可按此方法進行頭孢丙烯原料的控制菌檢查。

表3 大腸埃希菌方法驗證試驗結(jié)果Tab 3 Escherichia coli method validation test results

2.5 微生物限度檢查驗證結(jié)果

綜合以上結(jié)果，通過5種試驗菌、3次平行試驗的回收率方法學(xué)驗證及控制菌方法驗證，頭孢丙烯原料的微生物限度檢查法：細菌計數(shù)及控制菌檢查用低速離心-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法(400 mL沖洗量)；霉菌和酵母菌計數(shù)用平皿法。

3 討論

頭孢丙烯在水中微溶，故在制備1∶10供試液時，需45 ℃恒溫振搖；同理在考慮采用薄膜過濾法時，應(yīng)首先進行低速離心，去除不溶于稀釋劑的藥物顆粒。而有相關(guān)試驗文獻[5]和中國藥典2010版表明，采用500 r·min-1離心3 min，對細菌的回收率影響較小。不溶性藥物低速離心后，可因其質(zhì)量大于細菌細胞而下沉至管底，達到既去除顆粒沉淀，又不影響試驗對菌落數(shù)的檢出[2]。頭孢丙烯原料不溶于稀釋劑的組分基本被低速離心除去，大大降低了其抑制細菌和堵塞薄膜的作用。

再者通過薄膜過濾，除去頭孢丙烯一部分溶于稀釋劑的抑菌組分。最后通過酶中和法，基本除去了頭孢丙烯的抑菌作用。這里采用薄膜過濾-酶中和法聯(lián)用是為了減少沖洗量。過大的沖洗量不僅容易導(dǎo)致薄膜的破損，而且易損傷藥品中所含的微生物，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果出現(xiàn)。在沖洗過程中，對沖洗液的溫度應(yīng)控制在40~45 ℃為宜。過低的溫度容易使藥物析出，堵塞或吸附在薄膜上；過高的溫度容易傷害樣品中的污染菌，導(dǎo)致假陰性。每次沖洗時，還應(yīng)振搖濾器，使吸附在薄膜中的藥物更容易被洗脫除去。

采用沖洗液最后一次過濾前加入部分酶，是因為頭孢丙烯對普通的β-內(nèi)酰胺酶有很強的耐酶作用，而專屬的頭孢菌素酶價格不菲，如每瓶沖洗液都加入酶進行沖洗，試驗成本過高，而且酶的濃度過稀，酶解反應(yīng)效率低。所以在最后一次沖洗液加50萬單位頭孢菌素酶反應(yīng)10 min，并在培養(yǎng)基中加入50萬單位頭孢菌素酶，可保證殘留在薄膜上的頭孢丙烯被酶中和掉。

通過低速離心沉淀-薄膜過濾-酶中和聯(lián)用法，去除了頭孢丙烯原料的抑菌成分，本方法用于頭孢丙烯原料的質(zhì)量控制有效可行。

REFERENCES

[1] YANG J W, WANG Q H, WU Z X, et al. Methodology validation study of microbial limit examination of Qingyi oral liquid [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 2012, 29(10): 939-941.

[2] HUO X, LIU B, LIU J H, et al. Establishment and validation of microbial limit method for Kangjunxiaoyan capsules [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 2012, 29(12): 1121-1124.

[3] MA X R, SU D M. Drug Microbiological Inspection Technology(藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)) [M]. Vol 7. Beijing: Hualing Press, 2007: 218.

[4] Ch.P(2010)Vol II(中國藥典2010年版. 二部) [S]. 2010: Appendix 107-116.

[5] YUAN L N, SONG Q. Experiments on the recovery of bacteria and fungi by the method of low speed centrifuge in microbial limit tests [J]. Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志), 2007, 27(10): 1620-1622.

Establishment and Validation of Methodology for Microbial Limit Test of Cefprozil APIs

HONG Liang, LU Qihuan
(Taizhou Institute for Food and Drug Control, Taizhou 318000, China)

OBJECTIVE To establish a method for microbial limit test of cefprozil APIs, and carry out the verification of methodology. METHODS According to the method of Chinese Paharmacopoeia 2010, microbial limitexamination of three batches of cefprozil APIs were studied. Low speed centrifuge, membrane filtration and enzyme neutralization method were used with count of bacterium and pathogenic bacteria test. The plate method was used with counts mold and yeasts. RESULTS The recoveries above 70% were obtained when comparing the product challenge to its corresponding inoculum control, and no growth was observed in the negative diluent controls. The Method could pass the validation test of Chinese Pharmacopoeia 2010 version. CONCLUSION The method can be used in microbial limit test of cefprozil APIs.

cefprozil APIs; microbial limit test; validation

R916.693

B

1007-7693(2013)10-1119-04

2013-04-15

洪亮，男，主管藥師 Tel: 13857660015 E-mail: letgohl@163.com