張 欣 于瑞祥 楊瑞鈺 方曉明 丁卓平

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院1，上海 201306）

（上海市標(biāo)準(zhǔn)化研究院2，上海 200031）

（上海出入境檢驗(yàn)檢疫局3，上海 200135）

角鯊烯常溫下為無色油狀液體，是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物。其最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱為2，6，10，15，19，23－六甲基 －2，6，10，14，18，22－二十四碳六烯，屬開鏈三萜，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯［1］。角鯊烯不僅具有促進(jìn)新陳代謝，活化細(xì)胞、強(qiáng)化內(nèi)臟的作用，還具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，能有效地防止細(xì)胞的老化和癌變、抗癌、防癌，提高機(jī)體的免疫力。目前，角鯊烯主要來自于深海鯊魚肝油，同時(shí)也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鯊烯［2］。

目前，關(guān)于角鯊烯的檢測分析以氣相色譜法居多［3－5］，也有采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，如陳全斌等［6］在檢測羅漢果種仁油中的角鯊烯時(shí)，將油用氯仿定容后直接進(jìn)行高效液相色譜分析。Murkovic等［7］采用高效液相色譜法分析橄欖油中角鯊烯含量，樣品除稀釋之外未做任何前處理，這樣不僅對色譜柱易造成損害，降低儀器靈敏度，而且樣品中較多雜質(zhì)的存在對目標(biāo)物質(zhì)的判斷產(chǎn)生干擾。Nenadis等［8］用高效液相色譜法測定橄欖油中角鯊烯時(shí)，將樣品用甲醇／乙腈（體積比為7∶3）的混合溶液提取，經(jīng)24 h冷凍后取上清液過濾，溶劑蒸發(fā)后所得的殘余物用乙腈定容，雖其對樣品進(jìn)行了前處理，但是花費(fèi)時(shí)間過長。

本研究建立了硅膠柱提取、HPLC法測定植物油中角鯊烯的方法，該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，測定低限（LOQ）為 5．0 mg／kg，與 Nenadis等［8］的定量檢測限（79 mg／kg）相比更低、更靈敏。本方法已應(yīng)用于實(shí)際樣品分析，對于植物性角鯊烯的開發(fā)及應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，美國Sigma公司。

石油醚：色譜純，沸程35～60℃，加拿大Caledon公司；正己烷：色譜純，美國 J．T．Baker公司；乙腈：色譜純，加拿大Caledon公司；叔丁基甲醚：色譜純，美國Sigma公司；無水硫酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，于500℃烘4 h以上，冷卻后儲存于干燥器中備用；硅膠60：0．063～0．200 mm，德國 Merck公司，于450℃烘5 h以上，冷卻后加入2%水，混勻，轉(zhuǎn)移至廣口試劑瓶中，蓋塞備用；水為超純水。

2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司，配2487型紫外檢測器；N－EVAP111型氮吹儀：美國Organomation公司；硅膠柱：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為帶活塞的砂芯玻璃層析柱（φ10 mm×250 mm），加3．0 g硅膠，頂端加0．5 cm無水硫酸鈉。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取100 mg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，得到1．0 mg／mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1．2．2 樣品處理

稱取植物油樣品0．50 g于小燒杯中（精確至0．001 g），加入5 mL石油醚，混勻，倒入硅膠柱中，然后重復(fù)2次用5 mL石油醚潤洗燒杯，洗滌液一并倒入小柱中，當(dāng)石油醚液面與上端無水硫酸鈉層相切時(shí)，加入30 mL石油醚，收集全部的45 mL洗脫液至50 mL收集管中，用氮吹儀氮吹至干，隨后用正己烷定容至2．0 mL（橄欖油與油橄欖果渣油用正己烷定容至4．0 mL），保鮮膜封口（防止正己烷揮發(fā)），充分振搖，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣小瓶，待測。

1．2．3 液相色譜條件

Kromasil 100－5C18柱（250 mm×4．6 mm），乙腈／叔丁基甲醚（75＋25，V／V）作流動(dòng)相，紫外檢測波長210 nm，柱溫25℃，流速1．0 mL／min。

2 結(jié)果與討論

2．1 硅膠柱凈化

2．1．1 2種濕法裝柱的比較

第1種是將稱量好的硅膠置于燒杯中，加入石油醚，攪拌，硅膠隨石油醚倒入小柱中，保持柱中硅膠填料被石油醚完全浸潤，然后柱上端加入約0．5 cm無水硫酸鈉。第2種是將稱量好的硅膠倒入事先裝有約25 mL石油醚的小柱中，靜置片刻，再加入0．5 cm無水硫酸鈉，打開塞子，使石油醚緩慢淋洗下來。2種方法相比較，前者在淋洗過程中，柱中易產(chǎn)生氣泡和間隙，洗脫過程容易斷裂，裝柱重復(fù)性較差，樣品回收率偏低；而后者，柱中硅膠填料均勻，不易出現(xiàn)氣泡和斷層現(xiàn)象，流速穩(wěn)定，重復(fù)性和回收率均好，故選擇后面一種濕法裝柱。

2．1．2 柱凈化效果

文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜法測定植物油中角鯊烯，通常采用溶劑稀釋后直接進(jìn)樣的方法［6－7］。圖1a為豆油用正己烷稀釋10倍后直接進(jìn)樣的色譜圖，由圖1a可以看出，過多的雜質(zhì)峰對角鯊烯的峰形產(chǎn)生干擾，此外，直接進(jìn)樣的方式會對色譜柱等造成一定程度的污染。為了改善角鯊烯的峰形，減少對色譜柱等的污染，提高儀器檢測靈敏度，本研究采用硅膠柱提取植物油中角鯊烯，圖1b為豆油分離色譜圖。由圖1b可見，經(jīng)硅膠柱提?。瘍艋螅酋徬┇@得基線分離，沒有雜質(zhì)峰干擾，大大提高了檢測靈敏度。

圖1 豆油色譜圖

2．2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈／甲醇、乙腈／叔丁基甲醚對分離體系的影響，采用乙腈／甲醇（40＋60，V／V）作流動(dòng)相時(shí)，在流速為1 mL／min的條件下，角鯊烯的出峰時(shí)間過長（約41．7 min），調(diào)整二者之間的比例仍達(dá)不到理想效果。叔丁基甲醚作為有機(jī)溶劑既利于脂溶性的角鯊烯在流動(dòng)相中的溶解，加速待測物質(zhì)的洗脫，又能防止其他脂溶性的大分子物質(zhì)在柱中的沉淀，延長色譜柱壽命，因此，嘗試在乙腈中添加叔丁基甲醚作為流動(dòng)相。以乙腈／叔丁基甲醚（75＋25，V／V）作為流動(dòng)相時(shí)，角鯊烯出峰時(shí)間較早，且其附近無干擾，具有較好的分離效果，色譜圖如圖1b所示，角鯊烯的保留時(shí)間為12．9 min。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取適量1．0 mg／mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度分別為2．0、10．0、50．0、100．0、250．0、500．0和 1 000 mg／L。按選定的色譜條件，取10μL進(jìn)樣，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，在上述濃度范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為y＝36 031x＋4 481，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0．998。

2．4 回收率、精密度和檢測限

豆油中角鯊烯含量較少，因此選擇它作為添加回收試驗(yàn)的樣品。樣品的添加量分別為5．0、100、500和1 000 mg／kg，每一添加水平的樣品數(shù)為8個(gè)，樣品處理和測定按1．2．2節(jié)和1．2．3節(jié)進(jìn)行。先測定樣品中角鯊烯的本底含量，再分別測定添加樣品角鯊烯的含量，扣除空白值后，計(jì)算添加回收率，加標(biāo)樣品的回收率及精密度結(jié)果見表1。由表1可見，平均添加回收率為82．4%～89．3%間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜7．1%（n＝8）。

以能準(zhǔn)確測定的最低濃度確定為測定低限（LOQ），本方法的 LOQ為5．0 mg／kg。

表1 加標(biāo)樣品的回收率及精密度（n＝8）

2．5 實(shí)際樣品分析

表2 各種植物油中角鯊烯含量

本方法對13種市售植物油樣品進(jìn)行分析，各樣品中角鯊烯含量見表2。從測定結(jié)果可以看出，特級初榨橄欖油和油橄欖果渣油中的角鯊烯含量明顯高于其他植物油，是植物性角鯊烯的良好來源。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的硅膠柱提取，HPLC法測定植物油中角鯊烯的方法，樣品經(jīng)硅膠柱提取／凈化，樣品回收率高、凈化效果好，減少了對色譜柱的污染，角鯊烯達(dá)到基線分離，避免了干擾組分對被測物峰的影響，大大提高了檢測靈敏度，較文獻(xiàn)方法靈敏、可靠，本方法已應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。

［1］吳立軍．天然藥物化學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：222

［2］官波，鄭文誠．角鯊烯提取、純化及其應(yīng)用［J］．糧食與油脂，2010（2）：44－46

［3］廖杰，趙玉蘭，李寧，等．植物油中角鯊烯的 GC／MS分析［J］．現(xiàn)代儀器，2008（5）：36－37

［4］鐘冬蓮，湯富彬，沈丹玉，等．油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測定［J］．分析試驗(yàn)室，2011，30（11）：104－106

［5］唐小紅，陳華勇，王永華，等．氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定深海魚油中角鯊烯含量［J］．油脂工程，2012（1）：50－53

［6］陳全斌，程忠泉，楊建香，等．羅漢果種仁油中角鯊烯的高效液相色譜分析［J］．廣西科學(xué)，2006，13（2）：118－120

［7］Murkovic M，Lechner S，Pietzka A，et al．Analysis of minor components in olive oil［J］．Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2004，61（1－2）：155－160

［8］Nenadis N，Tsimidou M．Determination of squalene in olive oil using fractional crystallization for sample preparation［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，2002，79（3）：257－259．