溫曉梨，孫宏衛(wèi)，歐小利，王妮，梅柱中，姜勇

在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的激活處于核心地位。有研究顯示，抑制p38MAPK與JNK激酶的功能可有效減輕炎癥癥狀[1]。雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatases 1，DUSP1)又稱MKP1絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAPK phosphatase 1)，在細(xì)胞內(nèi)主要催化已活化的MAPK家族成員(p38、JNK、ERK)特異性基序TxY中磷酸基團(tuán)的水解，從而抑制其活性。MAPK激活可快速誘導(dǎo)DUSP1基因的表達(dá)，是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[2-3]。近年發(fā)現(xiàn)，某些基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)存在富含腺嘌呤核苷與尿嘧啶核苷的元件(adenosine and uridine rich element，ARE)，多種ARE結(jié)合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)如人抗原R(HuR)、含KH結(jié)構(gòu)域的剪切性調(diào)節(jié)蛋白(KHSRP)、鋅指蛋白(TTP)等，均可通過與ARE的特異性結(jié)合而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)水平[4-5]。另外，小分子RNA(miRNA)也可通過識(shí)別3'-UTR特異性序列而介導(dǎo)靶基因mRNA的降解或(和)翻譯抑制。有研究顯示HuR和microRNA101可與DUSP1 3'-UTR結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控DUSP1基因的表達(dá)[6-7]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在DUSP1 mRNA的3'-UTR中存在3個(gè)ARE元件以及多個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步篩選可通過DUSP1 3'-UTR調(diào)控DUSP1基因表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白(RBP)和miRNA，本研究構(gòu)建了DUSP1 3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，并對(duì)其功能進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 真核表達(dá)載體pGL3-control、pRL-TK、pCDNA3.1、pcDNA3.1-HuR-FLAG、大腸埃希菌DH5α、NIH3T3和RAW264.7細(xì)胞(美國ATCC)，24孔板和細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning 公司，美國)，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清、總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司，美國)，DNA ladder、KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO，日本)，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(TaKaRa公司，日本)，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒、Dual-Luciferase? Reporter Assay System檢測(cè)試劑盒(Promega公司，美國)，jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus公司，法國)，mmu-miR101a(上海吉瑪公司合成)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序由Invitrogen公司(美國)完成。

1.2 方法 從GenBank獲得小鼠DUSP1 3'-UTR的編碼序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中miRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)采用TargetScan 6.0(http∶//www.targetscan.org)軟件進(jìn)行分析。

1.2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR的RT-PCR擴(kuò)增 RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2條件下在3.5cm皿中培養(yǎng)，達(dá)70%~80%融合時(shí)按Trizol試劑說明書提取總RNA。采用RT-PCR擴(kuò)增DUSP1 3'-UTR目的片段，上游引物為3'-AGGGCAAGGGGAGGTGTGGAG-5'，下游引物為3'-GAGAATTCCAATAGAAACGTCATAATTTATTC TG-5'，下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為693bp。采用KOD Plus 聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為： 94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 1min，35個(gè)循環(huán)。1.2.2 pGL3-Luc-DUSP1-3'UTR(LuDP)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 DUSP1 3'-UTR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用EcoRⅠ進(jìn)行酶切，pGL3-control載體先進(jìn)行XbaⅠ酶切并用Klenow DNA聚合酶大片段補(bǔ)平，然后采用EcoRⅠ進(jìn)行酶切，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切片段和pGL3-control載體的酶切片段通過瓊脂糖凝膠回收，采用文獻(xiàn)[8]中的方法將DUSP1 3'-UTR片段克隆至pGL3-control載體中熒光素酶(luciferase)編碼序列的下游，獲得LuDP重組質(zhì)粒，并對(duì)LuDP進(jìn)行PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切、DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3 LuDP/RL重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將LuDP用NotⅠ和BamHⅠ，pRL-TK用BglⅡ和XbaⅠ，pLenti6-TR用NotⅠ和XbaⅠ分別進(jìn)行雙酶切，將LuDP中的熒光素酶表達(dá)模塊與來源于pRL-TK質(zhì)粒的海腎熒光素酶(renilla luciferase，RL)表達(dá)模塊克隆至處理好的pLenti6-TR質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒LuDP/RL，對(duì)重組體進(jìn)行PCR擴(kuò)增及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。

1.2.4 細(xì)胞分組及熒光素酶活性檢測(cè) 將NIH3T3細(xì)胞以4×104/孔鋪于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24h后至細(xì)胞融合度約為40%時(shí)，按jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，0.1μg pRL-TK分別與0.1μg LuDP和pGL3-control(作為陽性對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，0.2μg LuDP/RL分別與0.1μg HuR表達(dá)載體(pcDNA 3.1-HuR-FLAG)和pCDNA3.1(作為對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，0.2μg LuDP/RL分別與50nmol/L mmu-miR101a和Control dsRNA(作為對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，48h后收獲細(xì)胞，采用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，具體操作按說明書進(jìn)行。

圖1 小鼠DUSP1 3'-UTR序列生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig. 1 Bioinformatics analysis of mouse DUSP1 3'-UTR sequence1. Potential binding site of miR-25/32/92abc/363-3p/367; 3. Potential binding site of miR429/200b/200c; 5. Potential binding site of miR-let7/miR98; 6. Potential binding site of miR144/miR101ab; 2, 4, 7. Adenosine and uridine rich elements (AREs)

圖2 LuDP重組質(zhì)粒的Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of plasmid LuDP by Hind Ⅲ/EcoR Ⅰenzyme digestionM. DNA ladder; 1. LuDP digested by HindⅢ/EcoRⅠ

圖3 LuDP/RL質(zhì)粒模式圖Fig.3 Schematic diagram of LuDP/RL

2 結(jié) 果

2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR生物信息學(xué)分析結(jié)果 從GenBank獲得小鼠DUSP1 3'-UTR全長序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其中含有3個(gè)ARE元件和4個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。

2.2 LuDP與LuDP/RL重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果 LuDP質(zhì)粒全長5954bp，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后可得到約2.2kb和3.7kb的片段，大小符合預(yù)期(圖2)。LuDP/RL質(zhì)粒大小為10 706bp，經(jīng)XbaⅠ單酶切后可得到約6.8kb、2860bp和320bp的片段，大小符合預(yù)期，經(jīng)HindⅢ單酶切后可得到3660、3354、2365、560、470、312bp的片段，大小符合預(yù)期。LuDP/RL質(zhì)粒模式圖如圖3所示，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)結(jié)果 將質(zhì)粒LuDP與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，48h后回收細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其熒光素酶活性是陽性對(duì)照(pGL3-control與pRL-TK共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞)的0.14±0.01倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明DUSP1 3'-UTR對(duì)基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。將LuDP/RL分別與RNA結(jié)合蛋白HuR表達(dá)載體、mmu-miR-101a共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，48h后回收細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染HuR表達(dá)載體后，其熒光素酶活性是對(duì)照組的1.40±0.20倍，而共轉(zhuǎn)染mmu-miR-101a后，熒光素酶活性是對(duì)照組的0.57±0.18倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控通常是由位于成熟mRNA的5'或3'端非翻譯區(qū)(UTR)的特異性調(diào)控元件與特定的RNA結(jié)合蛋白和(或)非編碼RNA相互作用，介導(dǎo)成熟mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)定位、蛋白翻譯，從而調(diào)控基因在細(xì)胞中的表達(dá)[9]。在參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的多種順式調(diào)控元件中，定位于mRNA 3'-UTR的ARE在基因表達(dá)調(diào)控中的作用研究得最多，多種ARE結(jié)合蛋白可通過與ARE元件的特異性結(jié)合而正向(如HuR蛋白)和(或)負(fù)向(如TTP蛋白)調(diào)控靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外，miRNA通過與3'-UTR結(jié)合而促進(jìn)靶mRNA的降解和(或)翻譯抑制也是近年來基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究熱點(diǎn)[7,10]。

前期研究表明，DUSP1是細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵性負(fù)調(diào)控因子[11]。Hammer等[12]采用LPS刺激來源于DUSP1基因敲除(DUSP1-/-)小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-6、IL-10、TNF、IL-1β和炎癥趨化因子等的表達(dá)明顯上調(diào)。但目前DUSP1基因調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，因此進(jìn)一步探討細(xì)胞炎癥反應(yīng)中DUSP1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制具有重要的理論與實(shí)踐意義。近年來已有報(bào)道指出RNA結(jié)合蛋白通過與3'-UTR的特異性結(jié)合而調(diào)控DUSP1基因表達(dá)，如Lin等[13]在誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的過程中發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白TTP可促進(jìn)DUSP1 mRNA的降解，而Kuwano等[6]報(bào)道RNA結(jié)合蛋白HuR在細(xì)胞受到H2O2刺激時(shí)可上調(diào)DUSP1 mRNA的表達(dá)。此外，多種RNA結(jié)合蛋白如NF90、TIA-1、TIAR等均被發(fā)現(xiàn)可與DUSP1 mRNA的3'-UTR相互結(jié)合[6]，但它們對(duì)DUSP1基因表達(dá)的調(diào)控作用尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DUSP1 3'-UTR含有3個(gè)ARE序列和4個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，提示轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控可能在DUSP1基因表達(dá)中具有重要地位。而本研究的初步結(jié)果也表明，將DUSP1 3'-UTR克隆至熒光素酶基因的下游可下調(diào)其在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)，表明DUSP1 3'-UTR中含有負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的順式作用元件。

為了便于采用siRNA文庫進(jìn)一步篩選通過3'-UTR調(diào)控DUSP1基因表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白及miRNA分子，本研究構(gòu)建了含有DUSP1 mRNA的3'-UTR全長序列的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒同時(shí)含有熒光素酶與海腎熒光素酶(RL)兩個(gè)各自獨(dú)立的表達(dá)模塊，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可將海腎熒光素酶作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)參照，從而降低不同樣品核酸轉(zhuǎn)染效率差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)由于海腎熒光素酶與熒光素酶基因位于同一個(gè)載體，其比例固定，便于不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較與統(tǒng)計(jì)。此外，本研究用熒光素酶及海腎熒光素酶的表達(dá)模塊替換了慢病毒表達(dá)載體pLenti-TR中的TR表達(dá)模塊，而保留了與慢病毒包裝相關(guān)的所有元件，因此所構(gòu)建的LuDP/RL載體可以通過慢病毒包裝，所獲得的假病毒可感染巨噬細(xì)胞等傳統(tǒng)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，有助于研究炎癥刺激對(duì)DUSP1基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)在NIH3T3細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染LuDP/RL與HuR表達(dá)載體和mmu-miR101a，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7]，表明已成功構(gòu)建了含有小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，該載體不僅可用于驗(yàn)證DUSP1 3'-UTR中調(diào)控元件對(duì)DUSP1的影響，還可作為篩選與DUSP1 3'-UTR結(jié)合并對(duì)DUSP1有調(diào)控作用的RBPs和miRNAs的平臺(tái)，為進(jìn)一步研究DUSP1基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Dong C, Davis RJ, Flavell RA. MAP kinases in the immune response[J]. Annu Rev Immunol, 2002, 20∶ 55-72.

[2] Li L, Chen SF, Liu Y. MAP kinase phosphatase-1, a critical negative regulator of the innate immune response[J]. Int J Clin Exp Med, 2009, 2(1)∶ 48-67.

[3] Liu Y, Shepherd EG, Nelin LD. MAPK phosphatases--regulating the immune response[J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(3)∶ 202-212.

[4] Caput D. Identification of a common nucleotide sequence in the 3'-untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986,83(6)∶ 1670-1674.

[5] Shaw G, Kamen R. A conserved AU sequence from the 3'untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation[J]. Cell, 1986, 46(5)∶ 659-667.

[6] Kuwano Y, Kim HH, Abdelmohsen K, et al. MKP-1 mRNA stabilization and translational control by RNA-binding proteins HuR and NF90[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(14)∶ 4562-4575.

[7] Zhu QY. MicroRNA-101 targets MAPK phosphatase-1 to regulate the activation of MAPKs in macrophages[J]. J Immunol,2010, 185(12)∶ 7435-7442.

[8] Hu SW, Sun MJ, Xia GX, et al．Construction and intracellular localization of eukaryotic expression vector transthyretin[J].Med J Chin PLA, 2009, 34(6)∶ 722-724.[胡水旺, 孫明晶, 夏高曉, 等. 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其細(xì)胞內(nèi)定位[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 34(6)∶ 722-724.]

[9] Anderson P. Post-transcriptional control of cytokine production[J]. Nat Immunol, 2008, 9(4)∶ 353-359.

[10] Hu G. MicroRNA-98 and let-7 confer cholangiocyte expression of cytokine-inducible Src homology 2-containing protein in response to microbial challenge[J]. J Immunol, 2009, 183(3)∶1617-1624.

[11] Yin W, Mei ZZ. Dual specificity phosphatase-1∶ a negative regulator of inflammatory response[J]. Int J Immunol, 2012,35(5)∶ 338-340.[殷為, 梅柱中. 雙特異性磷酸酶1∶ 炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子[J]. 國際免疫學(xué)雜志, 2012, 35(5)∶ 338-340.]

[12] Hammer M, Mages J, Dietrich H, et al. Dual specificity phosphatase 1 (DUSP1) regulates a subset of LPS-induced genes and protects mice from lethal endotoxin shock[J]. J Exp Med,2006, 203(1)∶ 15-20.

[13] Lin NY, Lin CT, Chang CJ. Modulation of immediate early gene expression by tristetraprolin in the differentiation of 3T3-L1 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 365(1)∶ 69-74.