研究背景

抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體(ANCA)的發(fā)現(xiàn)對于血管炎的研究具有里程碑的意義，自30年前ANCA首次在壞死性腎小球腎炎患者血清中發(fā)現(xiàn)以來[1]，其在血管炎中的地位逐漸被證實。Watts等[2]首次提出將小血管壁的炎癥和纖維素樣壞死、血清中ANCA的陽性、免疫抑制治療有效等為特征的三種疾病——韋格納肉芽腫(WG) 、顯微鏡下多血管炎(MPA) 、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(CSS)，統(tǒng)稱為ANCA相關(guān)性血管炎(AAV)。目前將特發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN)也納入AAV范疇。AAV累及腎臟稱為ANCA相關(guān)性腎炎,累及率約80%，累及率又隨疾病的不同而異[3]。AAV發(fā)生率及致死率較高，經(jīng)治療85%患者可緩解，該病易進入反復(fù)緩解復(fù)發(fā)狀態(tài)，約50%的患者5年內(nèi)反復(fù)復(fù)發(fā)，約20%的患者在發(fā)病5年內(nèi)進入終末期腎病[4]。人溶酶體相關(guān)膜蛋白2(hLAMP-2)是一種糖基化的1型糖蛋白，表達于中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等不同細胞溶酶體膜上，hLAMP-2免疫表位與大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌的黏附蛋白——Ⅰ型菌毛蛋白H(FimH)有高度一致性[5]，用FimH免疫大鼠后獲得的抗體能夠同hLAMP-2交叉反應(yīng)，并通過分子模擬作用導(dǎo)致大鼠發(fā)生 NCGN?？筯LAMP-2抗體是新近發(fā)現(xiàn)的一種ANCA亞型，與AAV關(guān)系密切，成為近年研究的熱點。本文就細菌感染、分子模擬致病及抗hLAMP-2抗體在AAV中的作用展開綜述，以期加深對AAV發(fā)病機制的認識。

AAV病因及發(fā)病機制

AAV的病因及發(fā)病機制目前并不十分清楚，近年隨著研究的深入，在以下方面取得較大進展：(1)ANCA 的直接致病作用被大量體外實驗及臨床研究證實[6,7]，但PR3-AAV動物模型尚不能成功建立，可能有其他復(fù)雜的免疫因素參與[8]。(2)T細胞及其調(diào)節(jié)作用在AAV中逐步被認識[9]，針對利用T細胞治療AAV，從而進一步證實T細胞在AAV中的作用[10]。(3)B因子、C3 等補體系統(tǒng)的激活，釋放其裂解產(chǎn)物C5a，與C5a受體結(jié)合致敏中性粒細胞，對中性粒細胞招募和激活起級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致小血管壁發(fā)生嚴重的壞死性炎癥[11]，支持補體系統(tǒng)參與疾病進展。(4)目前已知的多種基因編碼的蛋白質(zhì)能夠參與 AAV免疫反應(yīng)，如人類白細胞抗原(HLA) 蛋白 PTPN22、 CTLA4 等[12]，特別是Lyons等[13]的研究初步證實PR3-AAV和MPO-AAV在基因水平上是不同的自身免疫綜合征，這位為AAV的分類提供基因的依據(jù)。(5)微生物的感染一直是AAV的研究熱點，新近的研究在細菌誘導(dǎo)AAV發(fā)生和發(fā)展中的作用提出新的觀點，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，在PR3-AAV患者的血清中互補PR3中段和金黃色葡萄球菌蛋白之間存在同源性，如暴露于金黃色葡萄球菌環(huán)境下，可誘導(dǎo)抗PR3自身抗體產(chǎn)生，該抗體通過抗獨特型反應(yīng),誘導(dǎo)抗PR3 抗體的產(chǎn)生，引起AAV發(fā)病。Kain等[5]的研究提示細菌感染可能通過分子模擬產(chǎn)生抗hLAMP-2抗體，并導(dǎo)致NCGN發(fā)病。這些研究進展進一步加深了AAV的病因及發(fā)病機制的認識，為進一步的治療提供依據(jù)。

LAMP-2的生物學(xué)特征

LAMPs的分子生物學(xué)LAMPs是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，它覆蓋在溶酶體膜的表面，其主要由同源的Ⅰ型跨膜蛋白LAMP-1和LAMP-2組成，其結(jié)構(gòu)首先被Burnside等[15]發(fā)現(xiàn)，但直到1985年LAMP-2的單克隆及多克隆抗體制備成功，LAMP-2結(jié)構(gòu)才被更清楚地認識[16]，LAMP-2為一種跨膜糖蛋白，由N端頭區(qū)、跨膜區(qū)和C端的尾區(qū)組成[17]，C端尾區(qū)中的保守區(qū)域由11 個氨基酸殘基組成,N 端腔內(nèi)頭區(qū)含16～20 個糖基化位點,鉸鏈區(qū)有與氧基相連的多聚糖，N 端的糖基化具有穩(wěn)定溶酶體膜蛋白的作用，糖基化的程度與細胞的類型及活化狀態(tài)有關(guān)。LAMP-2多肽分子量為40～45 kD，而糖基化后的LAMP-2分子量約120 kD,編碼基因位于性染色體Xq24- q25[18]，其基因由 9個外顯子組成,第1～8 號外顯子和部分第9號外顯子編碼N端頭區(qū),9號外顯子余下部分編碼跨膜區(qū)和C端尾區(qū)。LAMP-2基因由于不同剪切可生成3種亞型——LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C[19]，他們有相同的膜外部分，三個亞型均存在作為靶抗原必需的氨基酸序列。但是跨膜膜內(nèi)部分不同，這影響其分布及功能[20],LAMP-2A和LAMP-2C主要分布于肝臟、肺等組織內(nèi)，而LAMP-2B主要分布于心肌和骨骼肌的溶酶體膜上。

LAMP-2生理作用LAMP-2對健康極為重要，它是維持溶酶體膜的完整性蛋白之一,LAMP-2與LAMP-1糖蛋白復(fù)合物充分地覆被在溶酶體膜上，應(yīng)用siMRA技術(shù)去除LAMP-2后溶酶體膜的通透性增加，導(dǎo)致溶酶體的完整性破壞和細胞的死亡[21,22]。同時LAMP-2的缺乏導(dǎo)致中性粒細胞防御功能部分喪失，增加牙齒的齒菌斑積累而導(dǎo)致嚴重的牙周炎[23]。

LAMP-2缺失的致病機制如下：(1)LAMP-2與自體吞噬有關(guān)，LAMP-2基因突變導(dǎo)致自噬小體的自體吞噬功能缺陷。(2)LAMP-2可控制分子伴侶介導(dǎo)的自噬的活性，這是一種對應(yīng)激的主要防御機制[24]；近來研究發(fā)現(xiàn),LAMPs 參與溶酶體膜與自噬小體的融合過程,當將吞噬小體受體轉(zhuǎn)染給胚胎纖維母細胞時則賦予其吞噬能力，LAMP-2 基因敲除后雖未損害溶酶體吞噬液體顆粒的能力,卻不能吞噬單體鳥苷三磷酸(GTP)酶或細菌至溶酶體，在中性粒細胞中觀察發(fā)現(xiàn),LAMP-2 缺失會引起相似的溶酶體和自噬小體融合障礙[25]，此研究結(jié)果表明LAMP-2表達的缺失選擇性的阻斷了非氧依賴的,以溶酶體為中心的殺菌途徑。(3) LAMP-2基因突變導(dǎo)致細胞器運動力喪失。對LAMP-1與LAMP-2雙重缺陷的小鼠進一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬小體與溶酶體向微管組織中心遷移時間延遲,動力蛋白依賴性的移動促進溶酶體與自噬小體融合,而兩者運動力減低或許是自噬小體成熟障礙的一個直接原因，LAMP-2 可能通過某種微妙的機制調(diào)節(jié)著自噬小體的成熟。(4)LAMP-2對抗原的遞呈起重要作用，特別是把細胞質(zhì)抗原通過組織相容性Ⅱ類分子遞呈給CD4+的T輔助細胞[26]。以上研究表明LAMP-2有其重要的生理功能，但抗LAMP-2的抗體是否干擾LAMP-2的功能目前不得而知。

抗LAMP-2抗體與AAV

抗LAMP-2抗體在AAV患者中的發(fā)現(xiàn)1995年,Kain等[27]在AAV患者血清中首先鑒定出抗hLAMP-2抗體的存在，通過免疫印跡法將純化的腎小球及中性粒細胞中膜蛋白與AAV血漿結(jié)合，分別發(fā)現(xiàn)在中性粒細胞中分子量為80～110 kD/170 kD和腎小球細胞中分子量為130 kD糖蛋白，這種分子量大小的差別反應(yīng)了在兩種類型細胞中的hLAMP-2糖基化程度的不同，在這項小樣本的研究中，抗體與不同糖基化水平的hLAMP-2的結(jié)合不受影響。Kain等[5]進一步研究表明通過重組hLAMP-2在大腸埃希氏菌及在中國倉鼠卵巢細胞中的表達，所有患者的抗hLAMP-2抗體能夠識別糖基化及非糖基化形式的hLAMP-2分子，這證實了抗體可識別天然糖基化的hLAMP-2膜外區(qū)域蛋白骨架上的表位。通過應(yīng)用患者的IgG標記識別表位，基于其氨基酸序列位置，結(jié)合表位定位在P41～49 和P331～341。有趣的是P41～49表位氨基酸序列與FimH氨基酸序列100%的同源性(90%完全一致)，而FimH是一種具有一型纖毛細胞(如大腸桿菌)的細菌黏附分子，F(xiàn)imH可與hLAMP-2抗體起交叉反應(yīng)，應(yīng)用FimH免疫大鼠可誘導(dǎo)抗LAMP-2抗體的合成，這揭示兩種分子間分子模擬的存在。

抗LAMP-2抗體及其類似物在實驗動物中的致病作用為證明這種新發(fā)現(xiàn)的抗hLAMP-2抗體致病性，Kain等[5]通過注入抗hLAMP-2抗體或分子類似物通過抗原激活免疫誘導(dǎo)損傷，從而同來檢測抗hLAMP-2抗體潛在的致病性。研究發(fā)現(xiàn)大鼠在注射抗hLAMP-2抗體2h后在腎小球內(nèi)皮細胞中可測出其存在，24h后其滴度在循環(huán)中迅速降低，隨后不能測出；且大鼠發(fā)生血尿、嚴重的蛋白尿和約25%大鼠發(fā)展成寡免疫復(fù)合物節(jié)段壞死性腎小球腎炎，而注入正常兔子球蛋白的大鼠未發(fā)生此類損傷。Roth等[28]也應(yīng)用WKY大鼠構(gòu)建了實施被動免疫研究，但沒有發(fā)現(xiàn)抗hLAMP-2抗體在腎小球沉積或?qū)е履I小球腎炎。對不同結(jié)果的最可能的解釋是應(yīng)用抗hLAMP-2抗體的不同。而在FimH和hLAMP-2交叉免疫反應(yīng)則提供了證實抗LAMP-2抗體致病性的機會，因為共同的hLAMP-2/FimH表位可以被患者的抗體所識別，應(yīng)用重組的FimH免疫大鼠產(chǎn)生抗FimH抗體，可以與人及大鼠的LAMP-2反應(yīng)，并能導(dǎo)致寡免疫復(fù)合物節(jié)段壞死性腎炎，這個研究證實應(yīng)用FimH免疫可導(dǎo)致FNGN，至少在實驗條件下證實兩種分子模擬致病的存在。在AAV患者中也發(fā)現(xiàn)帶有FimH的細菌感染的高發(fā)生率。Kain等[5]報道13例患者有9例在近3月有含有FimH的細菌感染，在Roth等[28]研究中有12%的患者有大腸埃希氏菌感染，均提示帶有FimH的細菌感染是AAV致病的原因之一，但需要更大規(guī)模的隨機對照多中心的研究去證實在人類中含F(xiàn)imH的細菌感染是否能誘導(dǎo)抗hLAMP-2抗體的產(chǎn)生，并發(fā)生AAV。

抗hLAMP-2抗體的檢測方法對抗hLAMP-2抗體的檢測目前仍是一個挑戰(zhàn)。認識hLAMP-2的表位的特征，糖基化水平對表位結(jié)合的影響，是臨床抗hLAMP-2抗體的檢測的關(guān)鍵。目前以hLAMP-2作為抗原的方法有：(1)初期研究中應(yīng)用的天然純化的糖基化抗原，由于量非常少，獲得困難，目前極少使用。(2)重組的hLAMP-2抗原，在大腸埃希氏菌表達的重組糖基化的hLAMP-2不如表達在哺乳動物的細胞內(nèi)的hLAMP-2穩(wěn)定，但是不易大規(guī)模的獲得，且其糖基化水平與其表達的變異性和表達細胞的類型均相關(guān)。通過轉(zhuǎn)基因方法能增加hLAMP-2的表達，但會導(dǎo)致糖基化的變異性和不確定性，和生理情況下并不同，這對其與抗體的結(jié)合的影響是不可預(yù)測的[5,28,29]。(3)間接免疫熒光法(IIF)通過hLAMP-2與抗體結(jié)合而檢測出抗體，細胞表面穩(wěn)定的表達全長的hLAMP-2已經(jīng)通過hLAMP-2A轉(zhuǎn)染IdID細胞實現(xiàn)，可通過IIF去量化hLAMP-2抗體[5]。

抗hLAMP-2抗體檢測在AAV患者中意義Kain等[27]最早的研究發(fā)現(xiàn)抗hLAMP-2抗體的陽性率是87%(13/15),但由于患者太少而不能評估出AAV患者的一般的陽性率。Kain等[5]通過一組84例腎活檢診斷為寡免疫復(fù)合物節(jié)段壞死性腎炎的隊列研究證實，其中78例(93%)患者通過非糖基化重組hLAMP-2應(yīng)用ELISA方法檢測到抗體陽性，同時應(yīng)用其他兩種方法證實。而在同一組患者中通過免疫抑制劑治療緩解后患者抗hLAMP-2抗體僅6例陽性(7%)，在其他30例腎臟疾病對照組中有1例陽性，健康對照組53例均為陰性。

隨后Kain等[29]研究中抗hLAMP-2抗體高陽性率被進一步確認，在歐洲三組隊列研究中的未治療的AAV患者抗hLAMP-2抗體的陽性率分別是81%、91%、80%，其陽性率是抗MPO和抗PR3抗體的兩倍，在8例ANCA陰性患者血漿中有7例測得抗hLAMP-2抗體的陽性，所有患者的血漿都分別用三種方法分別檢測(ELISA、immunoblot和IIF)，三種方法的一致性超過了80%。

抗hLAMP-2抗體與抗MPO和PR3 ANCA對治療的反應(yīng)不同，在一項縱向研究中Kain等[29]研究發(fā)現(xiàn)，43例患者中有42例在治療一月后抗體消失，在后來的隨訪中沒有臨床復(fù)發(fā)的患者抗hLAMP-2抗體保持陰性，進一步證實在臨床緩解中的病例其抗體是測不出的。與之形成對比的是在患者臨床緩解后經(jīng)典的ANCA通常仍然存在。抗hLAMP-2抗體在免疫開始治療后陽性率迅速降低，而在28例患者中有18例(57%)在疾病復(fù)發(fā)前抗hLAMP-2抗體從陰性變?yōu)殛栃裕@強烈的提示其與疾病的活動有關(guān)，但需要更多的數(shù)據(jù)證實。

臨床研究比較比較4篇抗hLAMP-2抗體在AASV的臨床研究，Kain等[5,27,29]的三項研究高度一致，而Roth等[28]研究與上述研究結(jié)果矛盾，從而引起了學(xué)者的關(guān)注，分析其結(jié)果差異可能的原因[30-32]，從而發(fā)現(xiàn)其結(jié)果的差異與入組病例不同和選擇的檢測方法不同密切相關(guān)。Kain等[5,27,29]的研究高度的一致性可能是因為所有hLAMP-2抗體均應(yīng)用多種方法檢測，這三項研究在未經(jīng)激素和免疫抑制劑治療的AAV患者的抗hLAMP-2抗體的陽性率在80%～90%，總陽性率89%(155/173)。

目前僅Roth等[28]研究與上述研究結(jié)果矛盾，總體的患者抗hLAMP-2抗體的陽性率僅21%。但這個數(shù)據(jù)包含了活動期及靜止期的患者，進一步比較兩組的入選患者及研究方法。Roth等[28]研究中103例來自北卡羅萊納州大學(xué)腎病中心(UNC)患者的抗體分別通過ELISA、Western Blot和IIF三種方法檢測，226例來自波士頓醫(yī)院的患者應(yīng)用了一種新的商業(yè)可獲得的hLAMP-2多肽片段，僅僅包含膜外1/4的序列。仔細分析UNC患者的選擇和分組方法，依據(jù)血管炎的嚴重程度和疾病活動情況進行臨床疾病活動指數(shù)打分(BVAS)，患者被分為兩組：一組是BVAS 0分的疾病緩解期的患者(58例)，另一組包括新發(fā)病的BVAS打分顯著大于0分的疾病活動的患者(45例)。這與Kain等[5，27，29]研究中所有患者均為新發(fā)病或復(fù)發(fā)，且BVAS打分均在10～15分有顯著不同。在UNC患者血漿中僅15例新發(fā)患者，其陽性率為47%，仍較Roth等[5，27，29]報道低很多，但高于健康對照組。所有BVAS 15分患者的血清應(yīng)用Western Blot和IIF檢測均為陰性，同時陽性對照組檢測結(jié)果仍為陰性，說明檢測的不是抗hLAMP-2抗體，這些進一步證實檢測方法的不一致造成結(jié)果的不一致。

通過比較發(fā)現(xiàn)不僅在病例入組還是檢測方法的選擇上，Kain等[5，27，29]和Roth等[28]均不同，這種病例及方法上的差異最終導(dǎo)致研究結(jié)果的不一致。

抗LAMP-2抗體與AAV致病機制

抗LAMP-2抗體在AAV中的致病機制目前研究較少，已知中性粒細胞在非特異性免疫系統(tǒng)中起十分重要的作用，在小血管炎腎臟損傷處大量浸潤,且外周的中性粒細胞也增高?？筁AMP-2抗體能激活中性粒細胞及內(nèi)皮細胞[5]，而中性粒細胞細胞外網(wǎng)絡(luò)(NETs)是Brinkmann 研究小組新近發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞另一種殺菌機制[33]，即從死亡的中性粒細胞釋放出來的核酸物質(zhì)和顆粒蛋白(彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和髓過氧化物酶等)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可捕殺病原體。Kessenbrock 等[34]研究證實小血管炎患者在有炎癥的腎臟中發(fā)現(xiàn)有NETs 沉積，循環(huán)血中也檢出髓過氧化物酶和彈性蛋白酶與 NETs 中的DNA 形成的復(fù)合物。唐莎等[35]研應(yīng)用抗 LAMP-2 抗體刺激中性粒細胞，發(fā)現(xiàn)LAMP-2抗體能促進NETs形成，且自身抗原 MPO、 PR3及LAMP-2包含在 NETs內(nèi)，而抑制還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性可阻斷NETs形成，說明LAMP-2抗體可能通過誘導(dǎo)中性粒細胞異常死亡，釋放內(nèi)源性危險信號，激活自身免疫反應(yīng)等來維持血管炎的惡性持續(xù)狀態(tài)。而抗LAMP-2抗體體內(nèi)外的是否有直接的致病作用，需要進一步研究闡明。

總 結(jié)

AAV腎損害是較常見的繼發(fā)性腎臟疾病，預(yù)后較差，病情容易反復(fù)，發(fā)病機制目前并不明確，近年來抗LAMP-2抗體在AAV中發(fā)現(xiàn)是研究的重大進展之一，特別是LAMP-2的表位與某些細菌的FimH具有同源性，在動物試驗中產(chǎn)生分子模擬效應(yīng)，進一步導(dǎo)致腎損害及寡免疫性新月體腎炎。雖無人體內(nèi)致病的直接證據(jù)，但ANCA患者中發(fā)病期有較高的含有FimH細菌陽性率，佐證了含有FimH細菌的致病性，為揭示細菌導(dǎo)致AAV的發(fā)病機制提供線索，但這需要大規(guī)模的臨床試驗證實。

ANCA對AAV的診斷價值目前被公認，但在ANCA陰性血管炎診斷中抗LAMP-2抗體診斷價值需要進一步驗證。其意義還在用免疫抑制治療后緩解患者的抗hLAMP-2抗體消失的速度比抗MPO和PR3快，病情復(fù)發(fā)前濃度會增高，是否抗hLAMP-2抗體比現(xiàn)有的方法能夠更真實的反應(yīng)疾病的活動度，如果是這樣的話，抗hLAMP-2抗體的檢測將極大地提高免疫抑制劑的個體化應(yīng)用。最近研究表明在過敏性紫癜[36]、皮膚結(jié)節(jié)性多動脈炎[37]及肺出血腎炎綜合征患者中[38]患者血清中發(fā)現(xiàn)了抗hLAMP-2抗體，這些研究表明抗hLAMP-2抗體可能參與AAV以外的其他血管炎及新月體腎炎發(fā)病機制，需要進一步研究證實。雖然當前存在AAV患者血清中的抗hLAMP-2抗體絕對陽性率及其與疾病活動性的關(guān)系尚存在爭議，多因檢測方法及入選病例偏差造成的，通過檢測方法的改進和設(shè)計良好的隨機、對照、雙盲研究，這些問題可能被解決。隨著抗hLAMP-2抗體的深入研究，必將為AAV的發(fā)病機制認識、診斷特別是ANCA陰性患者的診斷、病情活動的判斷及免疫抑制劑的個體化治療產(chǎn)生積極的影響。

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