劉 杰，陳 婷，易 軍，陳光輝，陳韻岱

細(xì)胞因子提取液對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

劉 杰，陳 婷，易 軍，陳光輝，陳韻岱

目的探討不同濃度細(xì)胞因子提取液對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響。方法本研究利用培養(yǎng)乳鼠的心肌細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及其搏動(dòng)率。細(xì)胞因子提取液以0、1%、5%、10%、20%、40%濃度對(duì)培養(yǎng)48 h的心肌細(xì)胞進(jìn)行刺激，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，用甲基噻唑基四唑（MTT）法測(cè)定各組光密度（OD）值，其中以0組作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中加入不同濃度細(xì)胞因子提取液刺激心肌細(xì)胞48 h后，由低濃度到高濃度，心肌細(xì)胞MTT產(chǎn)物的OD值依次為：（0.3456±0.0327）、（0.3044±0.1914）、（0.3052±0.1112）、（0.3354±0.2816）、（0.4902±0.2749）、（0.018±0.045），其中1%、5%與對(duì)照組比較P＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其它組分別與對(duì)照組比較P＜0.05，有顯著性差異。細(xì)胞存活率均在95%以上。結(jié)論10%、20%細(xì)胞因子提取液能高心肌細(xì)胞的活力。

細(xì)胞因子提取液；細(xì)胞活力；心肌細(xì)胞；MTT

細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）提取液一經(jīng)發(fā)現(xiàn)立即引起各國(guó)學(xué)者的濃厚興趣及極大的重視，一些生物技術(shù)公司也將其作為開(kāi)發(fā)的重要目標(biāo)。美國(guó)Amgen公司研究人員率先開(kāi)發(fā)了該因子，并證明該因子的療效［1］。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所完成了對(duì)人SCF基因的克隆和高效表達(dá)［1］。近年來(lái)越來(lái)越多的研究展示了細(xì)胞因子在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）治療方面的較好的前景，其血管和心臟的再生功能彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療在微血管病變和心肌梗死后心功能恢復(fù)方面的不足［2］。本研究的目的是探討此種細(xì)胞因子提取液對(duì)正常心肌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇出生第2～3 d的SD乳鼠，雌雄不限（由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物室提供）。

1.1.2 主要儀器與試劑 培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板（Coring），超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱（Heraeus），相差顯微鏡（OLYMPUS），恒溫水浴箱，酶標(biāo)儀（Biotek），胎牛血清（杭州四季青），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclon），胰蛋白酶（Sigma），細(xì)胞因子提取液（中科富華生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞的分離 取2～3 d的SD乳鼠，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取心尖部，用預(yù)冷的PBS洗滌3遍。將心肌剪成約1 mm3大小，越小越好；用0.0625%胰蛋白酶在37℃恒溫水浴箱中消化心肌組織。消化過(guò)程中采用分次消化時(shí)間（8 min×6次），第一次消化后自然沉淀并棄上清，以后自然沉淀后取上清；每次分離的上清液加等量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打終止消化，制成細(xì)胞懸液。第一次得到的細(xì)胞懸液存放在4℃冰箱保存以保持細(xì)胞活性。重復(fù)6次，用220目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，制成單細(xì)胞懸液。1 000 r／min離心10 min，棄上清，加入10%DMEM培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱［3］。

1.2.2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞懸液放5%CO2培養(yǎng)90 min后，采用差速貼壁分離技術(shù)，吸取培養(yǎng)瓶中的的細(xì)胞懸液，加入BRDU濃度為0.1 mmol／L，調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)為106／ml，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中和培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后換液，以后隔日換液。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 原代細(xì)胞分離后，調(diào)整細(xì)胞密度、接種及培養(yǎng)方法同1.2.2。24 h后，用MTT法測(cè)定OD值，每組各5個(gè)副孔，2個(gè)空白孔，測(cè)定至細(xì)胞出現(xiàn)平臺(tái)期。記錄不同時(shí)間的OD值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 MTT法測(cè)定 調(diào)整細(xì)胞密度、接種及培養(yǎng)方法同1.2.2。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分為兩組，每組各5個(gè)副孔。對(duì)照組用含10%的胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)，另1組按細(xì)胞因子濃度0、1%、5%、10%、20%、40%進(jìn)行刺激，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h加入MTT 20 μl，37℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150二甲基亞砜，震蕩10 min混勻，自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm測(cè)OD值。每孔OD值減去空白孔OD值為測(cè)試孔OD值。

1.2.5 心肌細(xì)胞存活率測(cè)定 分別計(jì)數(shù)，不同濃度組及對(duì)照組的培養(yǎng)細(xì)胞。取0.4%的臺(tái)盼藍(lán)液100 μl、細(xì)胞懸液100 μl、PBS 800 μl，取10 μl滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)、未染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)10次，取平均值。細(xì)胞存活率（%）＝活細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100。

1.2.6 心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)的測(cè)定 心肌細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，在倒置顯微鏡下觀察不同濃度組及對(duì)照組每分鐘心肌搏動(dòng)次數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)不同視野中的心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)。

1.2.7 心肌細(xì)胞的鑒定 用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定心肌細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，用橫紋肌肌動(dòng)蛋白（ɑ-actin）單克隆作為一抗，用SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，所用結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為具有顯著意義

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 心臟成纖維及內(nèi)皮細(xì)胞在90 min內(nèi)基本已貼壁。未貼壁細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞呈梭形，不規(guī)則星形可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞搏動(dòng)。培養(yǎng)48 h后，偽足相互交織成網(wǎng)，形成單層細(xì)胞，出現(xiàn)節(jié)律收縮運(yùn)動(dòng)，每分鐘30至90次不等。見(jiàn)圖1。

2.2 心肌細(xì)胞存活率結(jié)果 不同濃度細(xì)胞因子提取液刺激心肌細(xì)胞48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h。濃度1%、5%與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其它組分別與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、3、4。

2.3 不同濃度細(xì)胞因子提取液對(duì)心肌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞活力的影響 不同濃度細(xì)胞因子提取液刺激心肌細(xì)胞48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h。濃度1%、5%與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其它組分別與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖1 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖2 對(duì)照組心肌細(xì)胞培養(yǎng)96 h

圖3 20%細(xì)胞因子提取液培養(yǎng)96 h

圖4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)96 h存活率

圖5 不同濃度細(xì)胞因子提取液對(duì)心肌細(xì)胞的影響

2.4 心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)測(cè)定結(jié)果 不同濃度細(xì)胞因子提取液刺激心肌細(xì)胞48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)至96 h。濃度1%、5%、10%、20%與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），濃度40%與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)96 h每分鐘搏動(dòng)次數(shù)

3 討 論

細(xì)胞因子是由骨髓微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白。其糖基連在肽鍵的N和O集團(tuán)上，相對(duì)分子量為（31～36）×103，由非共價(jià)鍵結(jié)合的兩個(gè)相同亞基組成，分為可溶性SCF蛋白編碼248個(gè)氨基酸，有跨膜區(qū)，在第6外顯子中有一蛋白酶切位點(diǎn)，經(jīng)蛋白酶水解去掉跨膜區(qū)，最終產(chǎn)物為N末端165氨基酸，仍可溶性，并具有干細(xì)胞因子活性；膜結(jié)合型SCF蛋白編碼220個(gè)氨基酸，有跨膜區(qū)［4］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子具有十分重要的生理功能。它參與機(jī)體發(fā)育中的多種細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控，是多種哺乳動(dòng)物干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵因子［4］。

有研究顯示急性心肌梗死本身引起的外周血SCF濃度升高和干細(xì)胞數(shù)量的增多，這些干細(xì)胞數(shù)量的增多可能與體內(nèi)的SCF濃度有關(guān)［2］。Kuhlmann等［5］在心肌梗死鼠的模型上更深入的發(fā)現(xiàn)SCF除了可以促進(jìn)心肌梗死局部的心肌血管的新生，還可以上調(diào)心肌梗死處的縫隙連接因子的表達(dá)，從而減少心肌梗死后的惡性心率失常。本研究顯示，通過(guò)細(xì)胞因子提取液對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞刺激24 h后，心肌細(xì)胞的OD值比對(duì)照組明顯升高。

通過(guò)試驗(yàn)可以看出本研究的10%、20%細(xì)胞因子提取液能高心肌細(xì)胞的活力。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度細(xì)胞因子提取液繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，48 h后細(xì)胞，其中20%濃度的OD值（0.4902±0.2749）與對(duì)照組比較有顯著性差異。根據(jù)活細(xì)胞線粒體在能量代謝過(guò)程中可作用于MTT產(chǎn)生藍(lán)紫色結(jié)晶產(chǎn)物這一原理，測(cè)定細(xì)胞因子提取液對(duì)培養(yǎng)中心肌細(xì)胞的增殖及活力的影響。MTT法強(qiáng)調(diào)MTT反應(yīng)所形成的甲臜結(jié)晶，取決于活細(xì)胞的數(shù)量和其新陳代謝的強(qiáng)度，而死細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)，無(wú)結(jié)晶產(chǎn)生，使其反應(yīng)更加準(zhǔn)確［6］。MTT為淡黃色唑氮鹽，是線粒體脫氫酶的作用底物，當(dāng)與活細(xì)胞共同孵育時(shí)可以被具有活性的線粒體脫氫還原為不溶于水的藍(lán)色結(jié)晶，將其溶于有機(jī)溶劑后可用比色法測(cè)定其吸光度（OD）值，OD值越大反應(yīng)脫氫酶活性越大，活細(xì)胞的數(shù)量就越多，細(xì)胞的新城代謝就越旺盛。

綜上所述，筆者認(rèn)為，細(xì)胞因子提取液能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的活性，且20%細(xì)胞因子提取液能高效提高心肌細(xì)胞的活力。

［1］劉馳，李晁金子.細(xì)胞因子對(duì)心肌細(xì)胞增殖的作用［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2008，20（9）：741-743.

［2］嚴(yán)軼文，戴秋艷，張治，等.急性心肌梗死患者外周血干細(xì)胞及干細(xì)胞因子的變化［J］.中華老年心腦血管病雜志，2007，9（2）：82-85.

［3］馬芳芳，沈曉麗，林立芳，等.新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，18（2）：125-127.

［4］潘玥，張鳴，譚順革.干細(xì)胞因子研究概況［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26（9）：597-595.

［5］Kuhlmann MT，Kirchof P，Klocke R，et al.G-CSF／SCF reduces inducible a nhythmias in the infarcted heart potentially via increased connexin43 expression and arteriogenesis［J］.J Exp Med，2006，203（1）：87-97.

［6］陳光輝，祝善俊，劉莉，等.血管緊張素Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞活力的影響［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，21（4）：267-269.

The effects of cell factor extract on the viability of cardiac myocyte

Liu Jie，Chen Ting，Yi Jun，Chen Guang-hui，Chen Yun-dai
Institute of Geriatric Cardiology，PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Chen Guang-hui，Email：chen kevin301＠m(xù)sn.com

ObjectiveOur study sought to investigate the effects of different cytokine extract concentration on the viability of cardiomyocytes.MethodsCell survival rate was detected by trypan blue staining，and we observed the cell morphological change and pulsation under the inverted microscope.The cytokine extracts of increasing concentrations ranging from 0%to 40%were added to the culture medium to stimulate the cardiomyocytes that had been cultivated for 48 hours.Fourty hours later，we used MTT to measure OD of each group.ResultsOur result showed that the survival rates of all the groups were above 95%.The OD of the control group was 0.3456±0.0327.The ODs of other groups were as follows：0.3044±0.1914（1%group），0.3052±0.1112（5%group），0.3354±0.2816（10%group），0.4902±0.2749（20%group）and 0.018±0.045（30%group）.The ODs of 10%group and 20%group were significantly higher than that of the control group.ConclusionThe cytokine extracts of concentration at 10%and 20%could improve the viability of cardiomyocytes.

Cell factor extract；Cell viability；Cadiocyte；MTT

R654.1

A

1672-1403（2013）03-0186-04

2013-05-06）

2013-06-20）

100853北京，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科

陳光輝，Email：chen kevin301＠m(xù)sn.com