杜翠紅，曹敏杰*

(集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021)

魚類的肌肉中普遍存在一種肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase，MBSP)。該酶可有效降解肌原纖維中的肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)，對α-輔肌動蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白也具有不同程度的降解作用。在魚糜制品生產(chǎn)過程中，MHC的降解作用被認為是導致凝膠劣化的主要因素。因此，本實驗室多年來一直致力于不同魚類MBSP的分離純化及其酶學性質(zhì)研究。研究發(fā)現(xiàn)，MBSP是一種與胰蛋白酶性質(zhì)相似的蛋白酶，但其熱穩(wěn)定性優(yōu)于哺乳動物的胰蛋白酶。在現(xiàn)代蛋白質(zhì)化學研究中，常用胰蛋白酶或蛋白內(nèi)切酶Lys-C作為工具酶將蛋白質(zhì)降解為小肽段后進行質(zhì)譜鑒定。但胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性差，而蛋白內(nèi)切酶Lys-C價格偏高，影響了其實際使用。因此，將MBSP開發(fā)為蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中的工具酶，具有很好的應(yīng)用前景和商業(yè)價值。本實驗通過基因重組技術(shù)獲得了重組MBSP并實現(xiàn)其體外高效表達，為大規(guī)模生產(chǎn)MBSP奠定基礎(chǔ)。

1 魚類MBSP的分離純化及其特性研究

1.1 魚類MBSP的分離純化

對于魚類MBSP的研究早在20世紀60年代由日本研究者開展，目的是解明魚糜制品在50～65℃條件下長時間加熱而引起的凝膠強度下降的原因[1]。但由于MBSP在魚肉中含量很低，又與肌原纖維蛋白結(jié)合，很難用常規(guī)的方法將其從肌原纖維中解離出來，因此，對MBSP的分離純化就成為對其進行深入研究的瓶頸。直到1997年，Osatomi等[2]從淡水鯉魚(Cyprinus carpio)肌肉中純化得到了MBSP。所采用的分離純化方法的主要特點是首先將肌原纖維蛋白在高鹽濃度(2.0mol/L KCl)下進行酸處理(pH 4.0)，使肌原纖維蛋白變性而實現(xiàn)與MBSP的分離；然后將粗酶液濃縮后進行凝膠過濾層析使其得到初步純化；而后采用Arginine-Sepharose4B柱親和層析，最終獲得電泳級純度的MBSP。但從3.0kg的鯉魚肌肉中僅獲得約75μg的MBSP純品，由此可見鯉魚肌肉中MBSP的含量極低是其分離純化困難的原因之一。分別采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和凝膠過濾層析對MBSP蛋白進行分子質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示它是一種分子質(zhì)量為28kD的單亞基蛋白。隨后，本研究采用類似的純化方法分別得到了部分純化的白鰱魚MBSP[3]和高度純化的鯽魚MBSP[4]，它們均為28kD左右的單亞基蛋白。以上研究結(jié)果為其他淡水魚類的MBSP分離純化提供了重要參考，同時也為淡水魚MBSP的酶學特性研究提供了保證。然而，采用類似的分離純化方法卻無法得到海水魚MBSP，而需要對其純化方法進行改進。2000年，Cao等[5]將海水狗母魚的肌原纖維在55℃、pH6.0條件下加熱處理5min，實現(xiàn)了肌原纖維蛋白與MBSP的分離。然后分別進行陰離子交換層析、凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析和親和層析，最終得到了純化的MBSP。分別采用還原型和非還原型SDS-PAGE對MBSP進行檢測，結(jié)果表明該酶為60kD左右的同源二聚體。海水魚和淡水魚MBSP的純化方法之所以差異較大，可能是由于它們與肌原纖維蛋白的結(jié)合方式及MBSP的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同所致。

1.2 魚類MBSP的酶學特性研究

關(guān)于魚類MBSP的酶學特性主要從底物特異性和蛋白酶抑制劑對其影響、最適溫度和熱穩(wěn)定性及最適pH值和pH值穩(wěn)定性等方面進行研究。底物特異性研究表明，淡水鯉魚、鰱魚和鯽魚的MBSP均可以通過切割精氨酸或賴氨酸殘基的羧基端而水解底物[2-4]。其中，對熒光底物Boc-Gln-Arg-Arg-MCA水解效率最高，同時對于胰蛋白酶的其他底物均有不同程度的水解，而且對精氨酸殘基的分解能力是賴氨酸殘基的5倍左右。但不能水解胰凝乳蛋白酶作用的底物，這不同于從白姑魚(White Croaker)[6]和六齒金錢魚 (Threadfi n-Bream)[7]肌肉肌漿蛋白中純化的胰蛋白酶型的絲氨酸蛋白酶。而來自海水魚狗母魚的MBSP特異分解精氨酸殘基，對賴氨酸殘基無效[5]。根據(jù)不同酶抑制劑對酶活性影響的研究結(jié)果顯示，大部分胰蛋白酶抑制劑(如DFP、STI及TLCK等)均可不同程度地抑制魚類MBSP的活性[2-5]，但常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF卻不能抑制MBSP的活性，這與從老鼠腸黏膜中純化的膜結(jié)合型特異識別精氨酸的絲氨酸蛋白酶[8]和腎上腺嗜鉻顆粒中的絲氨酸蛋白酶的特性相似[9]。綜合以上有關(guān)底物特異性和蛋白酶抑制劑的影響結(jié)果表明，魚類MBSP是一種與胰蛋白酶性質(zhì)類似的絲氨酸蛋白酶。淡水魚鯉魚、鰱魚和鯽魚MBSP的最適溫度和最適pH值均為55℃和8.0[2-4]；而海水魚狗母魚MBSP的最適溫度為50℃、最適pH值為7～8[5]。在底物特異性方面，海水魚狗母魚MBSP特異分解精氨酸殘基，而對賴氨酸殘基幾乎不產(chǎn)生分解?？梢姾Ｋ~和淡水魚的MBSP在酶學性質(zhì)上也存在差異。

1.3 魚類MBSP對肌原纖維蛋白的分解及MBSP抑制劑的研究

為了研究魚類MBSP對其自身肌原纖維蛋白的分解情況，本實驗研究了白鰱魚肌肉中MBSP的作用。SDSPAGE結(jié)果顯示，肌原纖維蛋白在55～60℃條件下加熱后MHC有明顯的分解現(xiàn)象，長時間加熱也導致α-輔肌動蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白的分解[10]。通過添加絲氨酸蛋白酶抑制劑和免疫印跡法證實，肌原纖維蛋白的分解是由于白鰱魚肌肉中存在的MBSP的作用所致。同時，通過考察純化的MBSP對肌原纖維蛋白的水解結(jié)果顯示，淡水鯉魚、鰱魚和鯽魚的MBSP在55～60℃之間可有效降解肌原纖維蛋白中的MHC，對α-輔肌動蛋白、肌動蛋白和原肌球蛋白也有不同程度的降解作用[2-3,9]。由于MHC是魚糜制品中形成凝膠的主要成分[11-12]，為了驗證MBSP對魚糜制品凝膠劣化的影響，Cao等[13]制備了添加MBSP和不添加MBSP的淡水鯉魚魚糜制品，并在不同溫度下考察了魚糜的凝膠強度。結(jié)果顯示，在55～60℃之間，添加MBSP的魚糜制品的凝膠強度明顯低于不添加MBSP的魚糜制品，由此證明MBSP是引起魚糜制品凝膠劣化的主要因素之一。最近，本實驗以海水魚藍圓鲹為研究對象，綜合比較了組織蛋白酶L和MBSP對肌原纖維蛋白的分解能力，發(fā)現(xiàn)MBSP對肌球蛋白重鏈和原肌球蛋白的分解較組織蛋白酶L更強[14]。

為了改善魚糜制品加工過程中的凝膠劣化現(xiàn)象，本實驗室通過在魚糜制品中添加大豆、綠豆胰蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)可有效抑制肌原纖維蛋白的降解，進一步證實了絲氨酸蛋白酶MBSP參與魚糜凝膠劣化的重要事實[15-16]。雖然國內(nèi)外對于絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究已有很多報道，但大多數(shù)抑制劑均是作用于整個絲氨酸蛋白酶家族，而特異性針對某一種特定絲氨酸蛋白酶的報道卻不多。2000年，Cao等[17]從白姑魚肌肉中首次發(fā)現(xiàn)了一種特異抑制白姑魚MBSP的抑制劑(MBSPI)，并分別從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、酶學性質(zhì)和免疫交叉反應(yīng)等角度證實MBSPI實際上是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose phosphate isomerase，GPI)。隨后，在海水狗母魚肌肉中也發(fā)現(xiàn)了GPI同樣具有MBSPI的功能[18]，但狗母魚GPI對鯉魚的MBSP沒有抑制作用，表明該抑制劑具有種屬特異性。2009年，Sun等[19]對淡水鯽魚GPI也進行了分離純化，研究表明鯽魚GPI對其自身的MBSP有特異的抑制效果，而對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及白姑魚MBSP均無抑制作用，從而說明該GPI為一種特異的絲氨酸蛋白酶抑制劑。通過鯽魚GPI對其自身MBSP的抑制動力學研究表明，GPI是MBSP的可逆競爭性抑制劑。以上研究結(jié)果為開發(fā)和研究魚類MBSP抑制劑奠定了基礎(chǔ)。最近，張賓等[20]研究了豆類胰蛋白酶抑制劑對鰱魚魚糜凝膠劣化的影響。結(jié)果顯示，與空白對照相比，添加0.5%～1.0%胰蛋白酶抑制劑的鰱魚魚糜凝膠的自溶降解速度和蛋白溶解度明顯受到抑制，且保水能力和凝膠強度顯著增強。由此可見，來源于大豆、綠豆等豆類的胰蛋白酶抑制劑可作為MBSP的抑制劑，用于魚糜制品。

2 魚類MBSP蛋白的N末端測序及其分子生物學研究

為了獲得魚類MBSP蛋白的一級結(jié)構(gòu)信息，我們先后將高度純化的鯉魚MBSP和鯽魚MBSP進行了N末端測序，鯉魚MBSP獲得了40個氨基酸殘基序列[21]，而鯽魚MBSP則獲得了27個氨基酸殘基序列[4]。二者的前27個氨基酸序列比對結(jié)果顯示它們有85%的同源性。將鯉魚MBSP的前40個氨基酸殘基序列與其他絲氨酸蛋白酶相比發(fā)現(xiàn)在兩個特定區(qū)域具有很高的相似性，其第40位上的組氨酸殘基(His40)被認為是絲氨酸蛋白酶的活性位點之一[21]。由于鯉魚MBSP和鯽魚MBSP的部分氨基酸序列在蛋白或核酸序列數(shù)據(jù)庫中并不存在，由此推測魚類MBSP是一類新型的絲氨酸蛋白酶。

根據(jù)鯉魚MBSP和鯽魚MBSP的N末端氨基酸殘基序列設(shè)計MBSP上游簡并引物，依據(jù)大多數(shù)絲氨酸蛋白酶的活性位點保守區(qū)域設(shè)計下游簡并引物，分別利用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE等技術(shù)獲得MBSP的全長cDNA。先后完成了鯽魚、鯉魚和鰱魚3種淡水魚MBSP基因全序列的分子克隆[4,22]，其中鯽魚和鰱魚MBSP的全長cDNA序列已登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號分別為DQ872434和EU661606)。測序結(jié)果顯示鯽魚MBSP的cDNA含有一個編碼242個氨基酸殘基的729bp大小的開放閱讀框。而根據(jù)N末端測序結(jié)果和生物信息學分析得知該蛋白帶有一個含20個氨基酸殘基的信號肽，其成熟蛋白含222個氨基酸殘基；而鯉魚和鰱魚MBSP的開放閱讀框編碼243個氨基酸殘基，其信號肽含21個氨基酸殘基，因此，其成熟蛋白也含222個氨基酸殘基。通過對這3種魚的MBSP氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)鰱魚和鯉魚MBSP成熟蛋白的相似性高達98.2%，而鰱魚與鯽魚MBSP成熟蛋白的相似性為80.63%。此結(jié)果為國際上首次報道的關(guān)于魚類MBSP一級結(jié)構(gòu)信息。從而為進一步研究魚類MBSP的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和MBSP的重組表達奠定了基礎(chǔ)。

將鯽魚MBSP氨基酸序列與其他絲氨酸蛋白酶(主要是不同來源的胰蛋白酶)氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示鯽魚MBSP與其他絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列的相似性在36%～55%之間。其中，與大麻哈魚胰蛋白酶的相似性為54.5%[23]；與鱈魚胰蛋白酶的相似性為52.2%[24]；與豬胰蛋白酶的相似性為55.1%[25]；與人胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶(KLK14)的相似性為47.2%[26]；與倉鼠的胰凝乳蛋白酶型絲氨酸蛋白酶的相似性為36.2%[27]。但這些酶在活性位點保守區(qū)域的相似度很高，與組成絲氨酸蛋白酶催化中心三聯(lián)體[28]對應(yīng)的氨基酸殘基分別位于魚類MBSP成熟蛋白氨基酸序列中的His40、Asp86和Ser176[4]。由此推測魚類MBSP與胰蛋白酶的催化機制類似，但需要通過定點突變等手段進一步驗證。

3 魚類MBSP的重組表達及其酶學特性研究

3.1 魚類MBSP的重組表達

由于天然MBSP蛋白在魚體肌肉中含量極低，分離純化難度較大，收率低。為了獲得大量的MBSP，本研究室根據(jù)MBSP的cDNA序列，采用基因重組技術(shù)，將鯽魚MBSP基因與pQE30表達載體連接，實現(xiàn)了MBSP在大腸桿菌中的高效表達和純化。重組MBSP的表達量可達菌體總蛋白的15%以上。由于重組MBSP中帶有(His)6標簽，利用固定金屬離子親和層析可簡單實現(xiàn)該重組蛋白的純化。然后，將高度純化的重組MBSP蛋白免疫小鼠，首次制備了抗MBSP特異性多克隆抗體，為今后對該蛋白酶的深入研究提供了有力的檢測工具。

然而，由于在大腸桿菌中表達的重組MBSP主要為包涵體形式，復性、純化后不具有生物學活性。為此，本研究室利用畢氏酵母表達系統(tǒng)對該蛋白進行分泌表達。將鯽魚MBSP成熟蛋白基因借助表達載體pPIC9K整合到畢氏酵母表達宿主GS115的染色體上構(gòu)建了重組酵母表達菌株[29]。由于在目的基因的上游存在乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子和一個酵母信號肽序列，該重組菌株經(jīng)甲醇誘導表達后，可在發(fā)酵液上清中獲得重組MBSP。SDSPAGE電泳和免疫印跡檢測結(jié)果顯示重組MBSP的分子質(zhì)量為36kD左右，而天然MBSP和大腸桿菌表達的重組MBSP均為28kD左右。這可能是由于該重組MBSP蛋白中含羥基的氨基酸殘基在酵母中發(fā)生了糖基化反應(yīng)。為此，我們又對該重組MBSP進行了糖含量測定[30]和PAS染色[31]，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白中糖含量為10.5%，且可以產(chǎn)生PAS顯色反應(yīng)，由此證明酵母表達的重組MBSP為糖蛋白。

3.2 重組MBSP的酶學特性研究

為了比較重組MBSP和天然MBSP的酶學特性，我們考察了酵母表達的重組MBSP的底物特異性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性及最適pH值和酸堿穩(wěn)定性[29]。結(jié)果顯示重組MBSP最適溫度和最適pH值分別為55℃和7.5，與天然MBSP類似。而重組MBSP的熱穩(wěn)定性略低于天然MBSP，在60℃條件下加熱30min后，天然MBSP酶活性仍保留80%，而重組MBSP酶活性殘留40%。但在25～55℃條件下加熱30min后，重組MBSP酶活性仍保留80%以上，其熱穩(wěn)定性同樣優(yōu)于胰蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶Lys-C。另外，重組MBSP在pH5.0～8.5之間酶活性仍保留75%以上，說明其具有良好的酸堿穩(wěn)定性。然而，重組MBSP在底物特異性方面卻與天然MBSP差異很大，其只能識別賴氨酸殘基的羧基端，而對精氨酸無效，這與蛋白內(nèi)切酶Lys-C的底物特異性類似。分析原因可能是由于重組MBSP在畢氏酵母中被糖基化或蛋白表達后在折疊過程中底物結(jié)合部位發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的變化，從而改變了其底物特異性。因此，還需要進一步通過去糖基化反應(yīng)或表達其他魚的MBSP等實驗進行驗證。同時，我們還考察了重組MBSP對鯽魚肌原纖維蛋白的降解情況，結(jié)果與天然MBSP的降解性能類似[29]。

4 魚類MBSP的應(yīng)用前景及展望

目前在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定中，常用胰蛋白酶或蛋白內(nèi)切酶Lys-C將蛋白質(zhì)降解為小肽段后進行質(zhì)譜分析，從而獲得該蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜[32-33]。由于重組MBSP具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性及對賴氨酸殘基羧基端特異分解的底物特異性，因此該類蛋白酶有望作為替代胰蛋白酶或蛋白內(nèi)切酶Lys-C等工具酶而應(yīng)用于蛋白質(zhì)化學、蛋白質(zhì)組學研究。目前我們已成功構(gòu)建了重組MBSP的畢氏酵母表達菌株，需要進一步優(yōu)化其高密度發(fā)酵條件并建立一套經(jīng)濟合理的純化工藝，以大規(guī)模生產(chǎn)重組MBSP。

盡管目前關(guān)于魚類MBSP的分離純化、酶學特性及分子生物學等方面已作了大量研究，但其與肌原纖維蛋白的結(jié)合方式、催化機制以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等問題還需要通過免疫組織化學、生物信息學分析和定點突變等手段進行深入研究，以期為開發(fā)新型的蛋白酶提供理論依據(jù)。

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