劉富兵，劉延琳*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西省葡萄-葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100)

酶在葡萄酒釀造中發(fā)揮著重要的作用。酶的使用不僅可以提高葡萄酒的澄清效果、促進(jìn)葡萄皮中色素物質(zhì)的釋放，提高浸漬效果而且有利于葡萄酒穩(wěn)定性的提高，最終實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)高質(zhì)量葡萄酒的目的。商業(yè)酶制劑作為高效生物催化劑廣泛用于葡萄酒釀造的各個(gè)工藝環(huán)節(jié)中，如澄清、過濾、浸漬、生物穩(wěn)定性處理等。這些酶制劑的使用在提高葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值方面效果也十分顯著。

1 果膠酶

果膠是細(xì)胞壁的主要構(gòu)成部分，是一種鏈狀的大分子物質(zhì)，存在于所有的果實(shí)中，影響果汁的壓榨與澄清效果。果膠酶是一種復(fù)合酶，能分解葡萄原料中的果膠。傳統(tǒng)果膠酶是由單一的纖維素和半纖維素酶構(gòu)成，主要用來澄清葡萄汁，而專業(yè)的果膠酶是由果膠裂解酶(pectin lyase)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、β-葡聚糖酶(β-glucanase)、果膠甲基酯酶(pectin methylesterase)等多種酶復(fù)合而成[1]。不同的酶作用于果膠長(zhǎng)鏈的不同部位。在葡萄酒生產(chǎn)過程中，使用果膠酶不僅能夠改善葡萄酒的澄清效果，而且還具有促進(jìn)有益物質(zhì)釋放、提高葡萄出汁率、增強(qiáng)葡萄酒的色澤和香氣等多重效果[2]。

1.1 果膠酶對(duì)果汁浸提和澄清的影響

葡萄酒釀造的浸漬階段添加果膠酶，不僅果汁總產(chǎn)量會(huì)有很大提高[3]，而且酒中苯衍生物、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯等含量會(huì)明顯增高[4]，這些物質(zhì)可以很好地改善葡萄酒的品質(zhì)。當(dāng)果膠酶質(zhì)量濃度為0.02～0.04g/L，穩(wěn)定處理4～10h，果汁產(chǎn)量可以提高15%以上[1]。Armada等[4]評(píng)估了在工業(yè)實(shí)驗(yàn)中，室溫條件下采用發(fā)酵前浸泡，利用2種商業(yè)果膠酶處理3h對(duì)葡萄酒釀造工藝參數(shù)的影響。統(tǒng)計(jì)分析和感官評(píng)定顯示：生產(chǎn)的葡萄酒在總的可溶固形物和最終的感官質(zhì)量方面發(fā)生了顯著的改變。與對(duì)照相比在香氣和味覺質(zhì)量上達(dá)到了更高的質(zhì)量水平。結(jié)果同時(shí)證明酶添加結(jié)合動(dòng)態(tài)浸漬處理使出汁率明顯提高。另外添加果膠酶可以降低葡萄汁的黏度，并導(dǎo)致顆粒狀物質(zhì)聚集，其中泥沙和顆粒容易通過沉淀去除，使葡萄汁達(dá)到很好的澄清效果。

1.2 果膠酶對(duì)多酚物質(zhì)的影響

葡萄酒中的多酚物質(zhì)主要是在浸漬階段和發(fā)酵期間從葡萄皮和葡萄籽中浸提獲得的。多酚物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化性，不僅能使血液中的高密度脂蛋白(HDL)升高，有效降低血膽固醇、防治動(dòng)脈粥樣硬化，而且還能抑制血小板的凝集，防止血栓形成[5]。在赤霞珠和蛇龍珠葡萄原料中加入不同濃度的果膠酶，會(huì)使發(fā)酵速率比未加果膠酶的更快，干浸出物含量和總酚含量增加，并且降低了酒中揮發(fā)酸含量，提高葡萄酒質(zhì)量[6]。Ducasse等[7]研究果膠酶對(duì)2004—2006年份陳釀20個(gè)月后的梅鹿輒葡萄酒中多酚和多聚糖物質(zhì)的影響，酶處理的酒中含有更多的鼠李聚糖半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖和少量的多聚糖，酶處理改變了酒中多酚物質(zhì)的組成，同時(shí)酒的色度增強(qiáng)。

不同成分的果膠酶可以促進(jìn)果皮中不同酚類物質(zhì)的釋放及其分子的改變。梅鹿輒和赤霞珠在果膠酶處理早期花青素從果皮中釋放出來，但是在進(jìn)一步的酶處理過程中被降解掉；黃酮醇從糖基化變?yōu)槿ヌ腔铀岚ㄋ畻钏岷土u基肉桂酸隨著單糖的釋放而被釋放出來；在酶催化果皮細(xì)胞壁降解的同時(shí)，許多酚酸可能從木質(zhì)素中釋放出來，在酶催化降解?；ㄇ嗨剡^程中會(huì)釋放出香豆酸[8]。所以可以運(yùn)用多種果膠酶處理分別促使果皮中不同酚類物質(zhì)的釋放及其分子的改變，進(jìn)而達(dá)到更好的效果。但是浸提酶和澄清酶一般不會(huì)同時(shí)使用，因?yàn)橥瑫r(shí)使用可能會(huì)抑制糖苷酶促進(jìn)香氣物質(zhì)的釋放[4]。果膠酶和表面活性肽結(jié)合使用對(duì)提高葡萄皮色素及多酚物質(zhì)的浸提效果非常顯著，但是在釀酒實(shí)踐中還需要做進(jìn)一步的研究。同時(shí)添加果膠酶和表面活性肽也可能成為將來干紅釀造浸漬過程中的一種新的方法[9]。

白藜蘆醇是存在于葡萄皮中的一種重要的強(qiáng)抗氧化物質(zhì)，它也具有很好的保健功能。白藜蘆醇二聚體是白藜蘆醇被4-羥基茋過氧化物酶氧化所形成的。在某些方面，白藜蘆醇二聚體與白藜蘆醇相比具有更強(qiáng)的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗HIV等[10-11]。在葡萄原料浸漬階段使用果膠酶，有利于胞內(nèi)有益物質(zhì)溶出，增加葡萄酒中白藜蘆醇的含量。不同的果膠酶和酵母在葡萄酒發(fā)酵中對(duì)白藜蘆醇含量有不同的影響。王蕾等[12]采用高效液相色譜直接進(jìn)樣分析, 測(cè)定了3種果膠酶處理、4種酵母發(fā)酵的葡萄酒中白藜蘆醇、ε-白藜蘆醇二聚體、δ-白藜蘆醇二聚體等葡萄主要芪化物的含量。結(jié)果表明：7種葡萄酒中都含有較多的白藜蘆醇、ε-白藜蘆醇二聚體和δ-白藜蘆醇二聚體。不同果膠酶、酵母的選用均能影響到葡萄酒中的白藜蘆醇、ε-白藜蘆醇二聚體、δ-白藜蘆醇二聚體的浸出效果。Ultrazyme Premium果膠酶酒樣中ε-白藜蘆醇二聚體含量為2.187mg/L，而Ex-v酒樣中為1.926mg/L，96酵母酒樣中白藜蘆醇含量為1.193mg/L，而CMS酒樣僅為0.682mg/L，δ-白藜蘆醇二聚體在D254酵母酒樣中的含量為2.297mg/L，而在Oneferm Color酒樣中僅為1.850mg/L。Ultrazyme Premium果膠酶和D254、796酵母對(duì)果皮中上述芪化物的浸提效果較好。因此在釀造過程中酵母菌株、果膠酶的選擇對(duì)葡萄酒中的重要有益物質(zhì)的影響也不應(yīng)忽視。

1.3 果膠酶對(duì)色素物質(zhì)的影響

不同的釀酒工藝、不同釀酒酵母及果膠酶處理對(duì)葡萄色素的浸提作用及引起顏色變化的情況也各不相同。果膠酶對(duì)顏色的影響略高于酵母；不同的酵母可以促進(jìn)果香及乙醇的生成，不同的果膠酶對(duì)單寧、色素的浸提，酒液的澄清能力也各不相同。

Vázquez等[13]研究了6種釀酒方法對(duì)葡萄酒的酚類化合物和顏色特性的影響。并且評(píng)估了這些方法對(duì)酒成熟過程中顏色穩(wěn)定性的影響。不過這一研究結(jié)果更加強(qiáng)調(diào)了選擇合適的釀酒方法對(duì)釀造優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒重要的重要性。Kelebek等[14]采用了一種快速的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)方法來分析2種果膠酶處理的葡萄酒中花青素的含量，可檢測(cè)到的花青素化合物有13種，與對(duì)照相比，果膠酶處理使葡萄酒含有更高的色澤強(qiáng)度。

不同酵母和果膠酶對(duì)原料葡萄色素的浸提作用及引起顏色變化的情況各不相同。王建剛等[15]研究了蛇龍珠干紅葡萄酒釀造過程中顏色的變化規(guī)律。在發(fā)酵前期紅色色調(diào)值迅速上升，顏色在第3天最深；后期逐漸下降；黃色色調(diào)值逐漸上升；果膠酶對(duì)顏色的影響略高于酵母；Zymaflore F15酵母促進(jìn)果香的生成；而Actiflore F33酵母轉(zhuǎn)化乙醇能力較高；Lafase HE果膠酶對(duì)單寧、色素的浸提更加有利；而Optizyme果膠酶有利于酒液的澄清；Zymafl ore F15 酵母與Lafase HE 果膠酶組合，更適于釀造更顯果香、圓潤(rùn)、平衡和醇厚的蛇龍珠干紅葡萄酒。另外葡萄酒釀造過程中添加酶和單寧可以促進(jìn)紅酒的成熟，因?yàn)樗鼘?dǎo)致了若干穩(wěn)定的主要顏色聚合物的形成[13]。

2 糖苷酶

目前，國(guó)外對(duì)葡萄與葡萄酒中風(fēng)味前體物及其風(fēng)味修飾中的關(guān)鍵酶(如β-D-葡萄糖苷酶)已有很多報(bào)道[16]；而國(guó)內(nèi)對(duì)β-D-葡萄糖苷酶的研究起步較晚[17]。β-D-葡萄糖苷酶作為葡萄酒香氣修飾的關(guān)鍵酶，其來源多樣[18-19]。與萜烯類香氣前體物質(zhì)有密切關(guān)系，可以水解糖苷鍵將香氣物質(zhì)從結(jié)合態(tài)變成游離態(tài)，從而達(dá)到增香的目的，已被廣泛應(yīng)用到食品工業(yè)領(lǐng)域[20]。

2.1 糖苷酶對(duì)香氣物質(zhì)的影響

許多研究證明利用β-D-葡萄糖苷酶可不同程度地促進(jìn)葡萄酒風(fēng)味前體物釋放。如Martino等[21]利用來源于黑曲霉的經(jīng)純化后的β-D-葡萄糖苷酶制劑來研究其對(duì)白葡萄酒香氣的影響，結(jié)果表明，酶處理后葡萄酒中單萜物質(zhì)含量(里哪醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)是原有含量的2倍，即其香味值(OAVS)可增加2倍，葡萄酒果香更加濃郁。游離態(tài)或固定態(tài)的酶制劑能夠促進(jìn)葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)顯著增加(約4倍)，尤其對(duì)于莫斯卡托葡萄酒，其萜醇(里哪醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇)含量顯著增加[22]。

Palomo等[23]以多個(gè)葡萄品種(阿依倫、阿爾比約、霞多麗)為試材，使用含β-D-葡萄糖苷酶制劑水解風(fēng)味前體物，以GC手段來分析香氣變化，得到的香氣物質(zhì)略有增加；主成分分析表明，品種香氣特征高于酶處理對(duì)其產(chǎn)生的影響；采用廣義最小二乘法來分析感官品嘗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酶處理后的葡萄酒與對(duì)照相比，具有較濃郁的花香、果香。

祝霞等[24]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS/SPME-GC/MS)，分析了β-D-葡萄糖苷酶處理對(duì)貴人香干白葡萄酒香氣物質(zhì)的影響。檢索定性出未加酶貴人香干白葡萄酒香氣物質(zhì)組分有55種，加酶處理的貴人香干白葡萄酒香氣物質(zhì)組分68種，主要包括醇類、萜類、酯類、醛類、酮類及酸類化合物。經(jīng)過AR2000β-D-葡萄糖苷酶處理后的葡萄酒中，新增了律草烯、乙酸葉醇酯、羅勒烯、金合歡烯、月桂烯醇、二氫月桂烯、紫蘇醇、甜橙醛共8種萜類化合物。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，糖苷酶處理對(duì)貴人香干白葡萄酒的香氣品質(zhì)具有良好的修飾作用。González-Pombo等[25]從陸生伊薩(Issatchenkia terricola)胞外提取純化的β-葡萄糖苷酶在100g/L葡萄糖、18%酒精、60mg/L偏亞硫酸氫鹽環(huán)境中表現(xiàn)出了很積極的活性，而且在pH值大于3.0的酸性條件下活性依然相對(duì)比較穩(wěn)定。將其固定于環(huán)氧瓊脂糖凝膠(epoxy-activated Eupergit C)中大大改善了它的穩(wěn)定性，通過GC-MS分析葡萄酒的香氣，結(jié)果顯示酶處理顯著增加了單萜類化合物的數(shù)量，表現(xiàn)出固定化酶在葡萄酒香氣形成中的運(yùn)用潛能。

Kang Wenhuai等[26]第一次建立一種方法——HS-SPME(頂空固相微萃取)和GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)聯(lián)用來描述葡萄中自由態(tài)的和結(jié)合態(tài)的揮發(fā)性化合物。通過比較高濃度的葡萄汁自由的和結(jié)合態(tài)的香氣物質(zhì)，顯示不揮發(fā)的配糖體被認(rèn)為是形成香氣的前提物質(zhì)。通過建立標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，在所有被鑒定的化合物中有11種被完全定量，其他的被半定量。在麝香葡萄中使用了3種不同的糖苷酶，總共有38種揮發(fā)性物質(zhì)被鑒定出來，包括萜烯類、高級(jí)醇類、碳六化合物和酚類物質(zhì)。不同的酶對(duì)各種香氣有顯著性的影響。主成分分析顯示商業(yè)酶(Rapidase AR2000；produced by DSM)水解香氣特性明顯好于其他酶產(chǎn)品。

2.2 糖苷酶基因在釀酒酵母中的表達(dá)及運(yùn)用

因?yàn)榇蟛糠纸湍笇倬瓯憩F(xiàn)不出β-葡萄糖苷酶活性，所以非酵母屬的β-糖苷酶在葡萄酒香氣中的發(fā)展顯得越來越重要。從葡萄汁和發(fā)酵過程中分離出的酵母菌在低pH值、高體積分?jǐn)?shù)酒精和高葡萄糖中只有少部分酶能夠表現(xiàn)出積極活性[25]。因此將外源β-糖苷酶基因?qū)脶劸平湍钢斜磉_(dá)應(yīng)用便成為克服釀酒酵母這一自身缺陷的一種方法。王立梅等[27]通過反轉(zhuǎn)錄PCR法成功地?cái)U(kuò)增出日本曲霉呋喃β-果糖苷酶基因，基因片斷長(zhǎng)度為1917bp，編碼638個(gè)氨基酸。將所得片段定向克隆到pYX212 載體上, 并轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá), 獲得的轉(zhuǎn)化子平均酶活為26.4U/mg。Michlmayr等[28]將酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶基因ATCC BAA-1163進(jìn)行克隆并讓其在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)分泌的糖苷酶特性與短乳桿菌(L.brevis)和腸系膜明串珠菌(L.mesenteroides)中分離出的β-糖苷酶特性相似，最佳pH值為5.0～5.5，Km=0.17mmol/L。在存在酒精條件下測(cè)定了其活性，隨著酒精體積分?jǐn)?shù)升高，β-糖苷酶相對(duì)活性逐漸降低，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)約為25%時(shí)酶的活性喪失，原因可能是高體積分?jǐn)?shù)酒精導(dǎo)致了糖苷酶基因的錯(cuò)誤折疊。

Villena等[29]研究了釀酒酵母β-葡萄糖苷酶在釀酒過程中的運(yùn)用。選擇適當(dāng)?shù)木曛?，?yōu)化了酶合成的條件：在有氧條件下，向培養(yǎng)基中添加纖維二糖以誘導(dǎo)胞外酶的產(chǎn)生，在生長(zhǎng)了42h時(shí)酶產(chǎn)量達(dá)到了最大值。酶被純化后，測(cè)定了其生化特性。并且將純化的酶運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)室釀酒中，同時(shí)以廣泛使用的來源于真菌的各種商業(yè)酶制劑相為對(duì)照，通過氣相色譜和質(zhì)譜法分析檢測(cè)萜烯類物質(zhì)含量。結(jié)果顯示2種酶處理均促進(jìn)了香氣前體物質(zhì)的釋放，增加了葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)成分，而且揮發(fā)性物質(zhì)成分比較相似，酶處理與葡萄酒香氣物質(zhì)含量具有很好的相關(guān)性。這一結(jié)果也表明來自釀酒酵母的酶可以替代商業(yè)酶制劑用在葡萄酒釀造中。

3 葡聚糖酶

β-葡聚糖是酵母菌等真菌細(xì)胞壁的主要組成部分，而β-葡聚糖酶是木霉屬所產(chǎn)可以用來降解β-葡聚糖。傳統(tǒng)的葡聚糖酶用來改善受灰霉菌感染的葡萄所釀的酒。因?yàn)榛颐咕鷷?huì)分泌葡聚糖到果汁中導(dǎo)致過濾阻塞。酵母菌的細(xì)胞壁由葡聚糖鏈和甘露糖蛋白組成。自然情況下酵母自溶是一個(gè)很漫長(zhǎng)的過程。自溶對(duì)葡萄酒質(zhì)量有很多好處，自溶中釋放的多糖可以改善酒的口感，釋放的甘露糖蛋白可以改變葡萄酒蛋白的穩(wěn)定性，釋放的一些自溶物質(zhì)可以改善葡萄酒的風(fēng)味和復(fù)雜性。自溶釋放很多氨基酸和核苷酸到酒中，這對(duì)于乳酸發(fā)酵來說是非常有利的，但同時(shí)它們也是許多細(xì)菌和酒香酵母的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，會(huì)增加酒香酵母污染的風(fēng)險(xiǎn)性。目前商業(yè)β-葡聚糖酶在過濾、澄清、陳釀等環(huán)節(jié)中已被廣泛使用。

3.1 β-葡聚糖酶抗葡萄酒腐敗菌

Enrique等[30]評(píng)估了商業(yè)β-葡聚糖酶制劑抗葡萄酒腐敗菌(Cryptococcus albidus、Dekkera bruxellensis、Pichia membranifaciens、Saccharomyces cerevisiae、Zygosaccharomyces bailii、Zygosaccharomyces bisporus)的能力。用不同酵母菌種檢測(cè)顯示它們對(duì)β-葡聚糖酶制劑有不同的敏感性。雖然在實(shí)驗(yàn)室條件下葡萄酒腐敗實(shí)驗(yàn)表明β-葡聚糖酶制劑對(duì)Dekkera bruxellensis和Zygosaccharomyces bailii的抗菌效率有所下降，但是β-葡聚糖酶制劑的添加對(duì)葡萄酒的參數(shù)沒有影響，而且這一結(jié)果表明β-葡聚糖酶制劑在葡萄酒中作為抗微生物制劑運(yùn)用的可能，同時(shí)表明控制腐敗酵母的抗微生物酶應(yīng)值得進(jìn)一步研究。β-葡聚糖酶除了改善過濾效果外，不會(huì)引起任何葡萄酒化學(xué)組成的重大改變。在皮渣浸泡之后的瓊瑤漿葡萄汁中添加了3種葡聚糖酶(Glucanex、Novoferm 12L和 Trenolin Buckett)，Trenolin Buckett處理的酒被認(rèn)為具有更理想的香氣和水果味。

3.2 外源β-葡聚糖酶基因的表達(dá)

張強(qiáng)等[31]用剛果紅法測(cè)定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力，研究重組釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表達(dá)的重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，并與源菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表達(dá)的原始酶的性質(zhì)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，重組酶保持了與原始酶相同的底物專一性。重組酶的最適反應(yīng)溫度為35℃，而原始酶為55℃。重組酶的熱穩(wěn)定性也發(fā)生了改變，40℃熱處理20min只保留63.4%的最初酶活力，但溫度再升高時(shí)對(duì)熱處理敏感度降低，70℃的熱處理20min 仍保留45.9%的最初酶活力；而原始酶50℃時(shí)穩(wěn)定，60℃以上的熱處理酶活力損失很大。與原始酶相比，重組酶的最適pH值下降為pH5.0，而原始酶為pH6.5；相比原始酶在pH7.0有最大穩(wěn)定性，重組酶在pH5.5時(shí)有最大穩(wěn)定性。重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最適反應(yīng)條件與原始酶相比更接近啤酒的實(shí)際生產(chǎn)條件。

4 溶菌酶

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種安全性很高的天然抗菌酶制劑產(chǎn)品，已受到相關(guān)國(guó)際管理機(jī)構(gòu)(WHO、FDA等)的認(rèn)可。溶菌酶分子質(zhì)量為14.6kD，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁黏多糖結(jié)構(gòu)，主要對(duì)革蘭氏陽性菌起作用。該酶制劑是在2001年批準(zhǔn)用于釀酒工業(yè)的，最大使用劑量不超過500g/t酒。目前，溶菌酶主要用于3個(gè)方面：蘋果酸-乳酸發(fā)酵(MLF)啟動(dòng)的預(yù)防性調(diào)控；酒精發(fā)酵停滯或延緩過程中對(duì)葡萄酒的保護(hù)；MLF結(jié)束后對(duì)葡萄酒微生物的穩(wěn)定。在MLF之前或結(jié)束后預(yù)防細(xì)菌腐敗，不僅可以保障葡萄酒良好的感官品質(zhì)，而且還能提升葡萄酒的衛(wèi)生健康質(zhì)量。因?yàn)楦瘮〖?xì)菌除了產(chǎn)生過量的醋酸，還會(huì)產(chǎn)生生物胺，這種物質(zhì)極易引起人體過敏反應(yīng)，如頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等。因此，采用一定的措施控制腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)很有必要[32]。

在葡萄酒釀造中，未發(fā)酵的葡萄汁中除了酵母菌外，乳酸菌是數(shù)量最多的微生物。片球菌屬(Pediococcus)、魏絲氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳酸桿菌(Lactobacillus)都是胞外多糖黏液、生物胺、乙酸和其他異味的產(chǎn)生者，都會(huì)導(dǎo)致葡萄酒不同類型的腐敗。不同的方法通常被用來控制微生物的生長(zhǎng)如加熱葡萄汁、添加亞硫酸鹽或者來自蛋清的溶菌酶。然而，由于存在健康風(fēng)險(xiǎn)，亞硫酸鹽的使用量應(yīng)該降低。

4.1 溶菌酶控制葡萄酒的腐敗

在葡萄原汁中加入100～150mg/L的溶菌酶，可以抑制乳酸菌(LAB)的生長(zhǎng)；當(dāng)酒精發(fā)酵(AF)完成，通過正常的接種起動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵，在白葡萄酒中加大溶菌酶的劑量至500mg/L，就可完全抑制MLF；如果AF中止，加入250～350mg/L的溶菌酶可抑制在重新起動(dòng)AF階段內(nèi)的LAB的生長(zhǎng)，從而能簡(jiǎn)化除去酒中過量的揮發(fā)酸的工藝，當(dāng)LAB超過160CFU/mL時(shí)，溶菌酶的量應(yīng)增大到500mg/L；一旦MIF完成后，若加入250～300mg/L的溶菌酶則可大大減少穩(wěn)定葡萄酒所需的SO2用量[33]。

Bl?ttel等[34]研究了一種來自鏈霉菌屬Streptomyces sp. B578的溶菌酶用于控制葡萄酒中的乳酸菌。這份研究中描述了來自于Streptomyces sp.菌株B578的胞外酶，它幾乎能夠溶解所有的與葡萄酒相關(guān)的乳酸菌和革蘭氏陰性醋酸菌。這種分解酶在釀酒條件下，如亞硫酸鹽和乙醇存在、低溫、低pH值條件下均表現(xiàn)出積極的活性。胞外酶組成分析表明，它和不同的細(xì)胞壁水解酶具有協(xié)同作用功能?？梢钥闯?，Streptomyces sp.B578的溶菌酶是一個(gè)用來控制葡萄酒腐敗細(xì)菌的很有前景的工具。Lasanta等[35]報(bào)道，利用0.0625g/L的溶菌酶可以很好控制甜型葡萄酒中乳酸菌的生長(zhǎng)。而且，當(dāng)溶菌酶和產(chǎn)膜酵母混合添加，葡萄酒中揮發(fā)酸含量可以明顯降低。Azzolini 等[36]研究了在不同釀酒工藝條件下溶菌酶對(duì)乳酸菌的抑制效果。通過2株菌和紅白葡萄酒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明紅葡萄酒中添加溶菌酶可以很好的抑制野生型的乳酸菌生長(zhǎng)，同時(shí)表明工藝類型對(duì)溶菌酶的抑菌效果有很大的影響。

4.2 溶菌酶對(duì)SO2的替代作用

Gerbaux等[37]曾在法國(guó)勃艮第產(chǎn)區(qū)的黑比諾葡萄酒中添加溶菌酶LYSO-Easy，并與傳統(tǒng)的SO2控制法進(jìn)行對(duì)比。在黑比諾葡萄酒中添加125g/t溶菌酶LYSO-Easy就可有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；若想達(dá)到同樣控制效果，需要添加50g/t的SO2。雖然，溶菌酶由于自身特點(diǎn)(只對(duì)革蘭氏陽性菌有溶菌作用，不具有抗氧化性)，還不能完全取代SO2，但它可以作為SO2的天然的、強(qiáng)有力的補(bǔ)充，使SO2的使用量大大降低[33]。Cejudo-Bastante等[38]在干白釀造中用溶菌酶和單寧酸取代SO2研究其對(duì)氨基酸消耗和生物胺生成的影響。在不同的釀酒酵母中，SO2或者溶菌酶對(duì)發(fā)酵過程中氮的消耗有不同的影響，然而單寧酸對(duì)其沒有實(shí)質(zhì)的影響。與添加溶菌酶比較，使用SO2可以增加丙氨酸和谷氨酰胺的消耗量，無論溶菌酶還是SO2處理對(duì)最終酒中的生物胺含量都沒有影響。

4.3 溶菌酶活性及其對(duì)葡萄酒的影響

雞蛋清溶菌酶在葡萄酒釀造中用來控制野生乳酸菌的生長(zhǎng)。Guzzo等[39]研究了葡萄酒中酚類物質(zhì)對(duì)蛋清溶菌酶的抑制效果。結(jié)果表明酚類物質(zhì)的存在可以降低溶菌酶活力，從而降低了實(shí)驗(yàn)乳酸菌的死亡率。該研究證明了溶菌酶抗乳酸菌活性大小與葡萄浸漬過程中釋放的低分子量花青素的總量相關(guān)。Tolin等[40]等還建立了一種用質(zhì)譜分析法快速檢測(cè)經(jīng)雞蛋清溶菌酶處理過的葡萄酒中的雞蛋蛋白質(zhì)的方法。通過LC-MS可以檢測(cè)到最低0.05g/L的量，而傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫發(fā)最低檢測(cè)量在0.50g/L，這種方法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法。通過這種方法的建立，對(duì)葡萄酒中殘留雞蛋白過敏的現(xiàn)象可以很好地避免。

Eggert等[41]研究了溶菌酶與葡萄酒中物質(zhì)的相互作用。1000mg/L的溶菌酶添加量對(duì)葡萄酒中多酚的含量，葡萄酒顏色及其抗氧化能力都沒有影響。酚類物質(zhì)沒有與溶菌酶發(fā)生共價(jià)結(jié)合。同時(shí)在模擬實(shí)驗(yàn)中溶菌酶的活性沒有受到錦葵色素葡萄糖苷和白藜蘆醇的影響，然而在紅葡萄酒中pH值和乙醇含量對(duì)溶菌酶的活性有非常大的影響。

5 尿素酶

酵母在精氨酸代謝過程中會(huì)生成尿素，當(dāng)葡萄酒中尿素含量過高時(shí)，酒精會(huì)與尿素生成氨基甲酸酯，EC具有很強(qiáng)的致癌性。尿素酶能將尿素轉(zhuǎn)化為氨離子和CO2，使用尿素酶可以降解酒中的尿素，進(jìn)而控制EC的生成。大部分尿素酶最適pH6～7，所以它們?cè)诰浦幸话悴槐憩F(xiàn)出活性。Suzuki等[42]最早在乳酸桿菌屬中發(fā)現(xiàn)了一種最適pH值為2.4可以用于葡萄酒中的尿素酶。1997年OIV批準(zhǔn)這種酶可以運(yùn)用于葡萄酒生產(chǎn)。同時(shí)，OIV規(guī)定尿素酶必須來源于發(fā)酵乳桿菌，最大使用量為75mg/L。當(dāng)葡萄酒中尿素含量超過3mg/L時(shí)就得使用尿素酶處理。當(dāng)尿素含量顯著降低時(shí)，必須過濾除去尿素酶，如果不去除可能會(huì)給消費(fèi)者帶來健康問題。雖然使用尿素酶可以很好地降低葡萄酒中尿素的含量，但在實(shí)際中技術(shù)和成本是主要的應(yīng)用限制因素。有研究者正試圖利用甲醇酸單胞菌(Acidomonas methanolica)生產(chǎn)尿素酶，以期研制出適用性更強(qiáng)、性價(jià)比更高的酶產(chǎn)品[32]。而Andrich等[43]將酸性尿素酶共價(jià)結(jié)合在不同大小的殼聚糖顆粒上，將這種結(jié)合物置于4℃、150～170d，其活性降低不到5%。所以由此看來這種固定化酶的使用將大大提高酶的使用效率，并且會(huì)節(jié)約更多的成本，具有非常重要的研究?jī)r(jià)值，應(yīng)用前景也將非常廣闊。

6 其他酶制劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

白葡萄酒易出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀，而傳統(tǒng)除去蛋白質(zhì)的方法無非是在葡萄酒中加入明膠或膨潤(rùn)土將葡萄酒中的蛋白質(zhì)除掉。當(dāng)然這是保持了葡萄酒的穩(wěn)定性，但另一方面將葡萄酒中穩(wěn)定性蛋白質(zhì)也除掉了，這就降低了葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。王華等[44]使用蛋白質(zhì)酶解法可將葡萄酒中蛋白質(zhì)水解成小肽，這樣既可使得葡萄酒具有很好的穩(wěn)定性，又可以提高葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。張傳軍[45]利用木瓜蛋白酶水解白葡萄酒中非穩(wěn)定蛋白，通過大量實(shí)驗(yàn)確定了酶反應(yīng)最佳條件為：加酶量為0.6g/100mL，在45℃反應(yīng)38h，酶反應(yīng)pH6.5。此條件下，白葡萄酒中的蛋白含量降低為0.31g/L，氨基酸含量升高至6.7mg/L。

7 結(jié) 語

酶作為高效生物催化劑在葡萄酒釀造中發(fā)揮著重要的作用。酶的使用不僅增加了葡萄酒理化性質(zhì)的穩(wěn)定性，而且大大改善了葡萄酒的香氣和色澤，提高了葡萄酒的質(zhì)量。果膠酶的使用，提高了出汁率和澄清效果，有利于浸提多酚物質(zhì)，這樣獲得的葡萄酒，單寧、色素含量和色度更高，顏色更深，抗氧化能力更強(qiáng)；糖苷酶主要促進(jìn)了葡萄酒香氣前體物質(zhì)的釋放，增加了酒的香氣成分；葡聚糖酶可以改善澄清、過濾、和陳釀效果；溶菌酶不僅可以防止葡萄酒腐敗，而且可以作為SO2天然有力的補(bǔ)充，降低因SO2使用而帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)；尿素酶的使用可降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(可能致癌的物質(zhì))的含量，對(duì)消費(fèi)者健康也大有裨益。在深入研究酶作用機(jī)理與葡萄原料組分的基礎(chǔ)上，專業(yè)高效商業(yè)酶制劑的研發(fā)勢(shì)頭強(qiáng)勁，市場(chǎng)上已近出現(xiàn)很多的滿足多樣化需求的酶制劑產(chǎn)品，例如DSM、Beverage Supply Group等公司都能夠提供專業(yè)的高質(zhì)量的葡萄酒生產(chǎn)全過程所用的酶試劑。這些酶制劑的運(yùn)用能夠更有效地浸提出活性抗氧化物質(zhì)(白藜蘆醇等)，改善葡萄酒風(fēng)味、色澤、穩(wěn)定性，有利于葡萄酒的陳釀后熟等過程，進(jìn)而可以不斷提高葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。

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