周奮翮 孫路明

（同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 上海 200040）

染色體非整倍體異常是一類常見的胎兒遺傳性疾病，發(fā)病率占出生胎兒的1/300。最常見的非整倍體異常即為21-三體綜合征（唐氏綜合征），其發(fā)生率約為1/800。人們通過不同的篩查方法，希望在孕期能夠盡可能的篩查出該病的高危人群。目前常用的篩查方法為早孕期和中孕期篩查，即控制檢出率達(dá)到90.0%，假陽性率在2.0%～5.0%的情況下，多采取孕婦年齡、胎兒超聲檢查結(jié)合母體血清學(xué)指標(biāo)綜合計(jì)算得出相應(yīng)的結(jié)果，其結(jié)果分為低危和高危[1]。對(duì)于高危人群，往往采取絨毛活檢或者羊水穿刺取樣，進(jìn)行胎兒染色體核型分析獲得確切的結(jié)果明確診斷。但無論何種方法，侵入性診斷始終存在約0.5%～1.0%的胎兒丟失率。

隨著通過母體外周血獲取胎兒細(xì)胞方法的逐漸成熟，越來越多的產(chǎn)科醫(yī)院開始嘗試無創(chuàng)的產(chǎn)前診斷方法。自1990年以來，這項(xiàng)技術(shù)被人們不斷探索并取得長(zhǎng)足進(jìn)展，為遺傳性疾病的高危人群提供了一種安全的產(chǎn)前診斷方法。該技術(shù)本身也存在一定的問題亟待解決，因此這項(xiàng)技術(shù)仍然在不斷的完善中，暫未大規(guī)模的應(yīng)用于臨床。本文結(jié)合最近一段時(shí)間文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道的復(fù)習(xí)，對(duì)無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于篩查21-三體綜合征的進(jìn)展進(jìn)行討論。

1 無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的進(jìn)展

1.1 利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞診斷胎兒非整倍體異常

由于孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)了胎兒細(xì)胞，故人們聯(lián)想到利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞診斷胎兒非整倍體異常。如果能夠獲得完整的胎兒基因組DNA，則可以進(jìn)行完整的胎兒染色體核型分析，從理論上可以作出這樣的推斷。困難在于，外周血中發(fā)現(xiàn)的胎兒細(xì)胞類型多樣，主要有滋養(yǎng)細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì)胞（NRBC）、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞等。相對(duì)其他細(xì)胞來說，NRBC是單核細(xì)胞，壽命短且穩(wěn)定，增殖能力有限，不滯留到下次妊娠。此外，NRBC有明顯的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特殊的細(xì)胞表面標(biāo)志物，易于識(shí)別，因此被認(rèn)為是理想的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷靶細(xì)胞[2]。

影響胎兒細(xì)胞應(yīng)用于臨床診斷的因素，首先是獲得的胎兒細(xì)胞數(shù)量太少且存在一定的背景干擾。不但有胎源性，也有母源性。因此，在利用NRBC進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷時(shí)，須對(duì)分離到的NRBC來源進(jìn)行鑒定，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。起初常用的方法為FISH技術(shù)（即原位熒光免疫雜交）。但人們發(fā)現(xiàn)采用FISH方法時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞難以進(jìn)行熒光標(biāo)記，且判讀結(jié)果依賴于人工，效率低下，這些因素都影響了孕婦外周血中胎兒NRBC在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用?，F(xiàn)階段提出可能的改進(jìn)方法為尋找新的特異性標(biāo)記物或改進(jìn)胎兒細(xì)胞的收集方法?？梢栽O(shè)想，如果孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞能夠培養(yǎng)成功，可以獲得足夠的應(yīng)用于核型分析的胎兒細(xì)胞，再結(jié)合改進(jìn)的FISH技術(shù)，如光譜核型分析可能使得非侵入性產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體出現(xiàn)突破性進(jìn)展。

1.2 利用孕婦血漿中游離胎兒DNA檢測(cè)胎兒非整倍體異常

有研究發(fā)現(xiàn)懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其血漿或血清中胎兒游離DNA濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但困難的是在孕11～17周，母體的游離DNA占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，使用傳統(tǒng)的DNA提取技術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)方法難以對(duì)胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。解決這一問題的途徑，一種方法是增加提取的胎兒DNA濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA；另一種方法是尋找孕婦外周血中新的胎兒特異性標(biāo)志物，使之不受高濃度母體背景DNA的影響[3]。近年來表觀遺傳學(xué)的研究為這一設(shè)想提供了可能，DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是最重要的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化調(diào)控了基因的表達(dá)但并不改變基因的序列。一般情況下，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。2002年P(guān)oon等[4]利用甲基化特異性PCR方法，不僅從母體血漿中檢測(cè)到了胎兒從父系繼承下來的甲基化等位基因，還檢測(cè)到從母系繼承來的胎兒非甲基化等位基因，說明胎兒與母體之間的基因位點(diǎn)上存在不同的甲基化形式。這一結(jié)果為無創(chuàng)傷性診斷胎兒非整倍體提供了依據(jù)。

Chim等[5]的研究顯示，編碼maspin基因的SERPINB5基因在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化。因?yàn)樘ケP是血漿中游離胎兒DNA的主要來源，而母血細(xì)胞是血漿中母體DNA的主要來源。推測(cè)利用胎兒和母血細(xì)胞之間存在的DNA甲基化狀態(tài)的差異，可以進(jìn)行胎兒非整倍體的檢測(cè)。唐氏綜合征由于其發(fā)病率高而備受關(guān)注，為了尋找21號(hào)染色體的表觀遺傳標(biāo)記，Hulten[6]采取了3種策略進(jìn)行篩選，結(jié)果在21q22.3發(fā)現(xiàn)了3個(gè)差異甲基化序列。其中AIRE基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG位點(diǎn)高度差異甲基化，可作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀遺傳標(biāo)記。Chim等[7]采用甲基化敏感的單核甘酸引物延伸和（或）重亞硫酸鹽測(cè)序的方法，系統(tǒng)性搜尋21號(hào)染色體上的甲基化位點(diǎn)，在114個(gè)CpG島中，有22個(gè)顯示出母體和胎兒間的表觀遺傳學(xué)差異。隨著這些表觀遺傳標(biāo)記研究的不斷深入，有可能使無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體成為現(xiàn)實(shí)。

1.3 利用孕婦血漿中細(xì)胞游離胎兒mRNA檢測(cè)胎兒非整倍體

2000年P(guān)oon等[8]在孕有男性胎兒的孕婦血漿中首次檢測(cè)到Y(jié)染色體特異性鋅脂蛋白（ZFY）mRNA。此后多項(xiàng)研究證實(shí)了孕婦外周血中存在著游離胎兒RNA。它們主要來自于胎盤，在孕婦血漿中含量豐富，具有極好的穩(wěn)定性，并且與血漿中胎兒的DNA一樣，于產(chǎn)后迅速?gòu)难獫{中清除。據(jù)此推斷，利用孕婦外周血中游離RNA檢測(cè)胎兒異常是可行的。選擇細(xì)胞游離胎兒RNA進(jìn)行無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的主要優(yōu)勢(shì)在于基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的多拷貝性。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是胎盤表達(dá)的特異mRNA種類是母體任何組織都無法表達(dá)的，易于檢測(cè)。與前述的利用表觀遺傳學(xué)差異選擇胎兒特異的標(biāo)記物一樣，分析胎盤來源的RNA類似利用胎兒DNA檢測(cè)Y特異序列或Rh D血型，母體血漿中完全缺乏這種物質(zhì)，因此檢測(cè)不受強(qiáng)大的母體DNA背景干擾。

2 臨床應(yīng)用中的相關(guān)問題

2.1 無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)是篩查還是診斷

回答這個(gè)問題牽涉到兩個(gè)方面，即向哪些人群提供這項(xiàng)技術(shù)以及如何使用這些技術(shù)。是否所有的孕婦都需要在早孕期進(jìn)行該技術(shù)的檢查？如果在唐氏篩查高危人群中，是否需要把無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷列同有創(chuàng)性介入性診斷一起作為一種選項(xiàng)？影響這些問題的答案受制于多種因素如技術(shù)的精確性，可擴(kuò)展性，實(shí)驗(yàn)室檢查持續(xù)的時(shí)間和成本-效益。顯然，成本-效益無疑是非常重要的，這也是其中的難點(diǎn)之一。那我們有必要對(duì)所有的孕婦提供無創(chuàng)技術(shù)嗎？

在歐美國(guó)家，政府制訂的政策為所有妊娠婦女均需要進(jìn)行唐氏綜合征的篩查或診斷。早孕期唐氏篩查的比例在逐漸升高，和中孕期唐氏篩查相比，早孕期篩查有更低的假陽性率。在英國(guó)，如果早孕期唐氏篩查風(fēng)險(xiǎn)高于1/150，則該孕婦需要接受侵入性的產(chǎn)前診斷[9]。早孕期篩查同樣能夠應(yīng)用于妊娠并發(fā)癥如子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胎兒心臟結(jié)構(gòu)異常及其他遺傳綜合征等。在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)的應(yīng)用過程中，需要超聲提供胎兒準(zhǔn)確的胎齡及胎兒的數(shù)量來確保檢查的準(zhǔn)確性。在一些唐氏篩查策略非常完善的國(guó)家，是否有必要用新的策略來代替現(xiàn)有的篩查方案也值得考慮。

我們把無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)作為序貫篩查的一部分，還是作為介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的替代品？這個(gè)問題屬于各個(gè)國(guó)家自主選擇的范疇，從全球范圍經(jīng)濟(jì)效費(fèi)比（效用/費(fèi)用的比例）考慮，完全替代現(xiàn)有的篩查方式顯然并不可取。從現(xiàn)有的早孕期唐氏篩查方案看，現(xiàn)有的篩查方法是能夠有效檢測(cè)出唐氏綜合征的。從篩查的角度看，目前早孕期唐氏篩查的檢出率，假陽性率和假陰性率是可以令人接受的。

2.2 經(jīng)濟(jì)學(xué)因素

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷與侵入性產(chǎn)前診斷之間的關(guān)系是目前探討的熱點(diǎn)。無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷花費(fèi)的多少取決于整個(gè)衛(wèi)生系統(tǒng)在唐氏篩查與診斷路徑中對(duì)于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷作用的認(rèn)識(shí)。在不同的國(guó)家，根據(jù)不同的特點(diǎn)采取不同的態(tài)度。顯然，隨著技術(shù)的發(fā)展，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)的成本會(huì)不斷下降，而其檢測(cè)的精確性會(huì)不斷提高。

以英國(guó)為例，結(jié)合最新報(bào)道的文獻(xiàn)[10]，我們來探討無創(chuàng)技術(shù)在唐氏篩查策略中的作用。在這項(xiàng)研究中，假定的篩查策略是將所有早孕期唐氏篩查高危的婦女都進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，如果無創(chuàng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果則進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷。如果以唐氏綜合征目前的發(fā)病率進(jìn)行預(yù)測(cè)，則每50萬名孕婦中可能有1 389例唐氏兒出生。以目前英國(guó)早孕期唐氏篩查截?cái)嘀?/150計(jì)算，大約13 646名孕婦需要進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，其中進(jìn)行無創(chuàng)檢測(cè)陽性的1 305名孕婦需要進(jìn)行絨毛活檢術(shù)，進(jìn)行胎兒染色體和性別分析的檢查。13名孕婦手術(shù)出現(xiàn)流產(chǎn)（以1.0%的胎兒丟失率計(jì)算），1 169個(gè)唐氏兒能夠得到確診。如果以每個(gè)無創(chuàng)性檢測(cè)需要￡ 200，則全部的篩查與診斷費(fèi)用需要￡ 29 700 000。

如果相同的早孕期唐氏篩查截?cái)嘀迪?，高危孕婦不做無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，則所有13 646名孕婦均需要進(jìn)行絨毛活檢術(shù)，發(fā)生流產(chǎn)的孕婦為136名，通過侵入性診斷可以檢測(cè)出1 181個(gè)唐氏兒。全部的費(fèi)用需要￡ 31 800 000。通過該研究發(fā)現(xiàn)，采取無創(chuàng)性產(chǎn)前技術(shù)后，能夠降低正常胎兒因接受有創(chuàng)檢測(cè)發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，換言之，避免了不必要的有創(chuàng)穿刺和流產(chǎn)。

如果將早孕期篩查的截?cái)嘀堤岣?，則顯然會(huì)有更多的孕婦需要接受無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，可以有更多的唐氏兒被檢測(cè)出，但總體的花費(fèi)需要增加。舉例說明，如果篩查的截?cái)嘀禐?/2 000，檢出率可以達(dá)到98.0%，50萬名孕婦中大約94 000名孕婦需要接受無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，大約1 348例唐氏兒可以被檢測(cè)出。如果每例無創(chuàng)檢測(cè)費(fèi)用仍然為￡ 200，則總體花費(fèi)達(dá)到￡ 46 200 000。如果每例無創(chuàng)的檢測(cè)費(fèi)用降低至￡ 50，則該篩查方案的費(fèi)用與目前早唐篩查1/150采取絨毛活檢方案的費(fèi)用基本相似，但流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)更低，且有更多唐氏兒（167）能被檢測(cè)出。

假如，我們放棄目前的早孕期唐氏篩查，全部采取無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)的話，假設(shè)每例檢測(cè)費(fèi)用在￡ 50，總體的費(fèi)用甚至比序貫篩查更低。無創(chuàng)技術(shù)和早唐篩查相比有更高的檢出率（99.0%），該技術(shù)有1.0%的假陽性率，約6 300名孕婦需要接受絨毛活檢術(shù)，約為目前篩查方案需要接受侵入性檢測(cè)孕婦數(shù)目的一半。

直至目前，關(guān)于無創(chuàng)技術(shù)在產(chǎn)前的適用范圍仍然在進(jìn)一步的討論中。目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，該技術(shù)主要應(yīng)用于唐氏篩查的高危人群，其中也有假陽性的存在，這顯示了有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)存在的必要性。我們把無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)視為“高級(jí)篩查”，這同時(shí)也顯示，對(duì)于假陰性的存在也是需要引起重視的。目前的研究表明，無創(chuàng)技術(shù)的假陰性較低，但目前提供的研究存在一定的局限性，比如，研究的樣本量較小，研究對(duì)象多集中于唐氏高危孕婦而非普通人群。對(duì)于該技術(shù)精確性的評(píng)判需要進(jìn)一步的研究。

從健康專業(yè)角度考慮，除非該項(xiàng)技術(shù)已被證明精確性非常之高，否則不宜在全球進(jìn)行大范圍的推廣。但是這樣的觀點(diǎn)往往并不與孕婦的意見一致。顯然在對(duì)待無創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用意見上，存在很多的分歧。一項(xiàng)來自英國(guó)的報(bào)道顯示，與專業(yè)醫(yī)生著眼于無創(chuàng)技術(shù)的準(zhǔn)確性相比，孕婦更加愿意接受其顯著的安全性。與此類似的一份美國(guó)的研究顯示，孕婦對(duì)無創(chuàng)技術(shù)主要關(guān)注的是其安全性（75.0%），關(guān)注度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精確性（13.0%）或更早的得知結(jié)果（7.0%）[11]。

2.3 倫理方面的討論

對(duì)于無創(chuàng)技術(shù)的倫理及社會(huì)學(xué)討論目前主要集中在以下方面：孕婦接受無創(chuàng)技術(shù)的檢測(cè)是否經(jīng)過充分的知情告知，對(duì)于終止妊娠數(shù)量增加所帶來的社會(huì)壓力等。令人擔(dān)心的一個(gè)問題是，孕婦往往并不清楚這項(xiàng)技術(shù)的方法與用途，僅僅簡(jiǎn)單的認(rèn)為是一項(xiàng)血液檢測(cè)。這樣類似的問題同樣也暴露在唐氏篩查的過程中，隨著無創(chuàng)技術(shù)的便捷性，終止妊娠也變得更加隨意。

目前可以看到的前景是將無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)引入到已成熟的唐氏篩查系統(tǒng)中。以往孕婦拒絕唐氏篩查和產(chǎn)前診斷的理由往往是擔(dān)心流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。目前的序貫篩查方案由于侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)使得孕婦在選擇接受唐氏篩查時(shí)，心理存在一定的阻礙。如果該方案降低了流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，孕婦可能不難作出自己的決定。因此，將無創(chuàng)性技術(shù)引入到產(chǎn)前篩查中，有助于孕婦的知情決策。另一關(guān)鍵點(diǎn)是對(duì)醫(yī)學(xué)專業(yè)人員進(jìn)行教育，以便能夠?qū)颊哌M(jìn)行正確的咨詢和指導(dǎo)。無論哪種篩查方案，無論何種技術(shù)，均存在自身的局限性。任何的篩查手段均有假陽性和假陰性的存在，如何讓孕婦在現(xiàn)有的條件下酌情選擇篩查的方案，在總體人群中切實(shí)降低流產(chǎn)的發(fā)生，提高唐氏綜合征的檢出率是我們努力的目標(biāo)。

2.4 商業(yè)因素

就現(xiàn)在開展的這些無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)，多數(shù)是通過商業(yè)行為提供的。對(duì)于這些新技術(shù)，一線臨床醫(yī)生并不十分確切的了解它們適用的最佳人群、檢驗(yàn)的成本、以及如何正確的解讀實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，但他們卻需要承擔(dān)對(duì)患者的咨詢。顯而易見的是，臨床醫(yī)生可能會(huì)過度把握無創(chuàng)技術(shù)的適應(yīng)癥。從患者需求的角度看，無創(chuàng)技術(shù)由于其特有的優(yōu)越性，無須過多宣傳，患者的接受度會(huì)很好。因此，許多供應(yīng)商把無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷作為抓住市場(chǎng)的重要機(jī)會(huì)。某些公司宣傳自己擁有該技術(shù)的全部知識(shí)產(chǎn)權(quán)，但目前法律上的訴訟并不完全支持這樣的觀點(diǎn)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，法律上的糾紛并不會(huì)因此而減少。作為圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)專業(yè)的醫(yī)生，應(yīng)盡可能避免商業(yè)因素成為篩查策略的考慮因素，應(yīng)該客觀的看待不同公司所提供的技術(shù)存在的利與弊。

3 小結(jié)

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)無疑是一個(gè)充滿活力的全新的發(fā)展方向，近10年來的表現(xiàn)非常奪目。它的飛速發(fā)展除了實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的進(jìn)步以外，臨床迫切的需求和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的開展也是其發(fā)展的主要推動(dòng)力。然而，該技術(shù)要在全球范圍內(nèi)廣泛得到推廣仍有漫長(zhǎng)的道路要走。這項(xiàng)技術(shù)取得進(jìn)展的同時(shí)，如何對(duì)它的應(yīng)用范圍、技術(shù)局限有清晰的認(rèn)識(shí)、如何對(duì)患者進(jìn)行正確的臨床指導(dǎo)，有賴于進(jìn)一步的研究和經(jīng)驗(yàn)積累。正確有效的咨詢能夠使患者充分了解各項(xiàng)技術(shù)的利弊并選擇最有利于自身的方案，并盡力避免商業(yè)因素成為臨床醫(yī)生作出決策的干擾。對(duì)于一個(gè)產(chǎn)前篩查平臺(tái)所要求達(dá)到的終極目標(biāo)是能夠進(jìn)行高通量的篩查，達(dá)到非常高的檢出率、很低的假陽性率和假陰性率，盡可能避免對(duì)孕婦的損傷，避免正常妊娠的胎兒丟失，能夠具有一定的成本效益。在這些方面，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)顯然具有非常好的前景。

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