李斐銘 葛曉英 王超群 黃必飛

●基礎研究

MicroRNA-143對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲和遷移的影響

李斐銘 葛曉英 王超群 黃必飛

目的 探討microRNA-143（miR-143）對人乳腺癌MCF-7細胞侵襲、遷移和增殖的影響。方法在脂質體介導下將miR-143抑制劑（miR-143 inhibitors）轉染入MCF-7細胞，以inhibitor negative control（inhibitor NC）作為陰性對照。通過MTS試劑盒檢測細胞增殖能力，以Transwell侵襲實驗和遷移實驗分別檢測細胞侵襲能力和遷移能力。結果（1）miR-143 inhibitors組與inhibitor NC組間細胞增殖活性無明顯差異（P＞0．05）；（2）Transwell侵襲及遷移實驗顯示轉染miR-143 inhibitors后，MCF-7細胞的侵襲及遷移能力均明顯增強（P＜0．05）。結論miR-143對人乳腺癌MCF-7細胞的侵襲及遷移能力存在負性調控作用，可能成為乳腺癌治療的潛在靶點。

miR-143 Transwell侵襲 遷移 增殖

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-143(miR-143)on invasion,migration and proliferation potential of human breast cancer MCF-7 cells．MethodsMCF-7 cells were transfected with miR-143 inhibitors by lipofectamine．MCF-7 cells transfected with inhibitor negative control were used as negative control(inhibitor NC)．Cell proliferation potential was evaluated by MTS kit,cell invasion potential and migrating ability were detected by transwell invasion and migration assay．ResultsThere were no significantly differences in cell growth between cells transfected with miR-143 inhibitors and inhibitor NC cells(P＞0．05)．Transfection of miR-143 inhibitors into MCF-7 cells led to a significant increase in cell invasion and migration detected by transwell invasion and migration assay(P＜0．05)．Conclusion MiR-143 negatively regulates the invasion and migration potential of human breast cancer MCF-7 cells and may be a potential target for breast cancer treatment．

MicroRNAs（miRNAs）是由長約20～24個核苷酸組成的非編碼小RNA，通過抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA來調節(jié)基因的功能，在生理或病理過程中發(fā)揮著重要的作用，如細胞增殖，分化，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等[1-2]。Iorio等[3]研究發(fā)現(xiàn)，相對于正常乳腺組織，miR-143在乳腺癌中表達明顯下調。目前有研究表明miR-143顯著抑制食管鱗狀細胞癌等腫瘤細胞侵襲遷移[4-5]，但其是否也參與調控乳腺癌侵襲轉移尚未見文獻報道。因此，本研究選擇乳腺癌細胞株MCF-7為模型，通過轉染miR-143抑制劑（inhibitors）抑制MCF-7細胞中miR-143表達，以探討miR-143對乳腺癌細胞侵襲、遷移和增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7購自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與耗材 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司產品)，OPTI-MEM(美國GIBCO公司產品），LipofectamineTM2000轉染試劑（美國Invitrogen公司產品），MTS細胞增殖/毒性檢測試劑盒(美國Promega公司產品），Transwell侵襲小室（美國Corning公司產品），基質膠（美國BD公司產品），miR-143 inhibitors及negative control（NC，上海吉瑪公司產品）。miR-143 inhibitors序列為5′-GAGCUACAGUGCUUCAUCUCA-3′；inhibitor NC序列為5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.3 儀器和設備 細胞培養(yǎng)超凈工作臺(上海智城分析儀器有限公司產品），全波長多功能酶標儀（美國BIORAD公司產品），CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱 (美國Thermo公司產品），倒置顯微鏡（日本Olympus公司產品），微量移液器（德國Eppendorf公司產品），顯微圖象采集系統(tǒng)（日本尼康公司產品）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基在37°C恒溫、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 轉染及實驗分組 miR-143 inhibitors及inhibitor NC干粉離心后加適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制成終濃度為20μM的工作液。取6孔板接種細胞后（每孔加入濃度為1×105個細胞/ml的細胞懸液2ml），按照LipofectamineTM2000說明書進行轉染。分為兩組：inhibitor NC組和miR-143 inhibitors組。

1.4.3 MTS法檢測細胞增殖 取6孔板中轉染后24h的MCF-7細胞，以每孔4×103個細胞接種于96孔板。每組設6孔。接種96孔板后24、48、72、96h各檢測一塊板。檢測時每孔加20μl MTS檢測試劑，并設置調零孔。置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標儀測定490nm波長吸光度值（OD490）。實驗重復3次。

1.4.4 Transwell侵襲及遷移實驗 取6孔板轉染48h MCF-7細胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，每個侵襲小室接種1×105個細胞。每個侵襲小室下室加含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600μl。其中侵襲實驗在小室接種細胞前加60μl基質膠（基質膠用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶8），而遷移實驗不加基質膠。遷移及侵襲實驗分別在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、28h后，取出小室用90%乙醇固定，0.1%結晶紫溶液染色，置于顯微鏡下觀察，選取4個低倍視野（×100）拍照并細胞計數(shù)，計算平均值。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 miR-143 inhibitors對MCF-7細胞增殖能力的影響 見圖1。

由圖1可見，細胞接種96孔板24、48、72、96h（即轉染48、72、96和120h）后，miR-143 inhibitors組和inhibitors NC組之間OD490值均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。

2.2 轉染miR-143 inhibitors后細胞侵襲及遷移能力的變化 miR-143 inhibitors組侵出小室的細胞數(shù)較inhibitor NC組均明顯增加（P＜0.05），詳見圖2、3。

圖1 miR-143 inhibitors對MCF-7細胞增殖能力的影響

圖2 兩組Transwell侵襲及遷移實驗鏡下圖片（a、b:侵襲；c、d:遷移；結晶紫溶液染色，×200）

圖3 兩組每低倍鏡視野（×100）的平均穿膜細胞數(shù)比較（*P＜0.05）

3 討論

近年來，隨著miRNAs在腫瘤中的具體作用及其機制研究的不斷深入，越來越多的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關miRNAs被發(fā)現(xiàn)。腫瘤中不同的miRNA表達上調或下調，提示編碼miRNA的基因可能起著癌基因或者抑癌基因的復雜作用[6]。研究表明，miRNAs通過影響癌細胞黏附、遷移、侵襲及腫瘤血管生成等對腫瘤進展過程中多個步驟起了調控作用[7]。

研究表明，miR-143在包括胰腺癌、食管鱗狀細胞癌、膀胱癌及結直腸癌等多種腫瘤細胞中表達顯著下調[4-5，8-9]，其中Hu等[4-5]發(fā)現(xiàn)miR-143能顯著抑制胰腺癌細胞和食管鱗狀細胞癌細胞的侵襲、遷移能力。這些結果表明，miR-143可能起著抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能。在乳腺癌中，Iorio等[3]研究不同miRNAs的表達改變，發(fā)現(xiàn)miR-143在乳腺癌中相對正常乳腺組織表達明顯下調。然而，關于miR-143是否參與調控乳腺癌侵襲轉移尚未見文獻報道。因此，為了明確miR-143對乳腺癌細胞侵襲、遷移和增殖的作用，我們將miR-143 inhibitors轉染至MCF-7細胞中，觀察其在MCF-7細胞中的作用，結果表明抑制miR-143表達對細胞增殖無明顯影響，但能夠顯著增強MCF-7細胞侵襲及遷移能力，表明miR-143對人乳腺癌細胞侵襲和遷移具有負性調控作用。

研究表明過表達miR-143抑制食管鱗狀細胞癌、膀胱癌、宮頸癌、結直腸癌及乳腺癌等多種腫瘤細胞增殖能力[5，8-11]。其中Noguchi等[8]研究表明miR-143和miR-145過表達對膀胱癌T24細胞和NKB1細胞增殖能力起顯著抑制作用，且兩者存在協(xié)同作用，但因膀胱癌SNK57細胞系中miR-143和miR-145表達水平高于T24和NKB1細胞系，因此miR-143和miR-145對其增殖能力無明顯影響。Yu等[11]發(fā)現(xiàn)上調miR-143表達可顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖能力。然而在我們的研究中，抑制miR-143表達對MCF-7細胞增殖能力無明顯影響。結合上述的研究結果，我們認為可能的原因是乳腺癌MCF-7細胞中miR-143表達低，因而抑制其表達不足以引起細胞增殖能力的顯著改變，有待于進一步證實。

關于miR-143調控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制，Yu等[11]證實miR-143以腫瘤細胞增殖相關基因bcl-2和survivin為靶點影響乳腺癌細胞增殖。在結直腸癌中，miR-143被證實以癌基因KRAS為靶點抑制其增殖[10]。另有研究表明miR-143以細胞外信號調節(jié)激酶5（ERK-5）為靶點抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖及侵襲、遷移[5]。 miR-143亦可通過調控pI3K/Akt及MAPK信號通路影響膀胱癌細胞增殖[8]。那么，miR-143是通過什么途徑調控乳腺癌細胞侵襲、遷移的呢?我們將在進一步研究中證實這個問題。

[1] He L,Hannon G J．MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J]．Nat Rev Genet,2004,5:522-531．

[2] Huang Y,Shen X J,Zou Q,et al．Biological functions of microRNAs:a review[J]．J Physiol Biochem,2011,67（1）:129-139．

[3] Iorio MV,Ferracin M,Liu C G,et al．MicroRNA Gene Expression Deregulation in Human Breast Cancer[J]．Cancer Res,2005,65 (16):7065-7070．

[4] Hu Y,Ou Y,Wu K,et al．miR-143 inhibits the metastasis of pancreatic cancer and an associated signaling pathway[J]．Tumour Biol,2012,33(6):1863-1870．

[5] Ni Y,Meng L,Wang L,et al．MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human esophageal squamous cell carcinoma[J]．Gene,2013,517(2):197-204．

[6] Hurst DR,EdmondsMD,Welch D R．Metastamir-the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading[J]．Cancer Res,2009, 69:7495-7498．

[7] Dumont N,Tlsty T D．Reflections on miR-ing effects in metastasis[J]．Cancer Cell,2009,16:3-4．

[8] Noguchi S,Yasui Y,Iwasaki J,et al．Replacement treatment with microRNA-143 and-145 induces synergistic inhibition of the growth of human bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt and MAPK signaling pathways[J]．Cancer Lett,2013,28,328(2): 353-361．

[9] Wang X,Tang S,Le S Y,et al．Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J]．PLOS One,2008,3(7):e2557．

[10] Chen X,Guo X,Zhang H,et al．Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis[J]．Oncogene,2009,28(10): 1385-1392．

[11] Yu X F,Zhang X M,Dhakal I B,et al．Induction of cell proliferation and survival genes by estradiol-repressed microRNAs in breast cancer cells[J]．BMC cancer,2012,12:29．

Effect of microRNA-143 on invasion and migration potential of human breast cancer MCF-7 cells

MiR-143 TranswellInvasion Migration Proliferation

2013-01-23）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012KYB230）

322100 東陽市人民醫(yī)院病理科（李斐銘、王超群、黃必飛）；東陽市婦幼保健院婦科（葛曉英）

李斐銘，E-mail：dyhospital@163.com