谷志靜，趙澤華，胡衛(wèi)華，何永志，趙文忠

（1.拉芳家化股份有限公司，廣東 汕頭 515065；2.中國(guó)科學(xué)院-拉芳發(fā)質(zhì)研究中心，北京 100101）

酶穩(wěn)定化技術(shù)及其在洗滌劑開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

谷志靜1,2，趙澤華1，胡衛(wèi)華1，何永志2，趙文忠1

（1.拉芳家化股份有限公司，廣東 汕頭 515065；2.中國(guó)科學(xué)院-拉芳發(fā)質(zhì)研究中心，北京 100101）

酶的穩(wěn)定性問(wèn)題是影響其在洗滌劑中應(yīng)用性能的重要因素。綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)工程﹑化學(xué)修飾﹑穩(wěn)定劑添加和微囊包載技術(shù)可增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，提升加酶洗滌劑的使用效果。本文概述了4種酶穩(wěn)定化技術(shù)的基本原理及其研究現(xiàn)狀；介紹了酶穩(wěn)定化技術(shù)在洗滌劑開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)展和發(fā)展前景。

酶制劑；穩(wěn)定性；洗滌劑；應(yīng)用

1．前言

早在1913年，Ro..hm就已將胰腺提取物用于洗滌劑的預(yù)浸泡組分Burnus，開(kāi)創(chuàng)了生物酶在洗滌劑工業(yè)中應(yīng)用的歷史。國(guó)外已商品化的洗滌劑用酶主要為水解酶類，包括堿性蛋白酶﹑淀粉酶﹑堿性纖維素酶﹑脂肪酶以及它們的復(fù)合物；新開(kāi)發(fā)的抗染料轉(zhuǎn)移功能或消毒殺菌效用的氧化還原酶類（如過(guò)氧化氫酶）也具有較好的應(yīng)用前景。

生物酶作為洗滌助劑是合成洗滌劑工業(yè)發(fā)展過(guò)程中的重大技術(shù)進(jìn)步之一，它促進(jìn)了洗滌劑工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展：降低了洗滌劑中表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量，有助于低磷或無(wú)磷洗滌劑的開(kāi)發(fā)；能夠改善洗滌性能，但自身無(wú)毒并能完全生物降解，可以減少污染物質(zhì)的排放；降低洗滌溫度，減少漂洗次數(shù)，有利于節(jié)能節(jié)水。

但是，由于生物酶自身易于降解以及洗滌劑配方技術(shù)的復(fù)雜性，如表面活性劑﹑漂白劑﹑蛋白酶等配方組分以及pH﹑溫度等配方條件的影響，酶的穩(wěn)定性成了加酶洗滌劑配方的突出問(wèn)題[1-2]。酶制劑公司和洗滌用品開(kāi)發(fā)商通過(guò)綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)﹑化學(xué)修飾技術(shù)﹑穩(wěn)定劑添加和微囊包載技術(shù)，來(lái)提高生物酶在洗滌劑中的穩(wěn)定性，改善其使用效果。

2．蛋白質(zhì)工程技術(shù)

蛋白質(zhì)工程技術(shù)主要是對(duì)已知酶分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，即酶的主鏈氨基酸的替換修飾。隨著二十世紀(jì)70年代基因重組技術(shù)的建立，人們通過(guò)生產(chǎn)菌株和表達(dá)系統(tǒng)的改造，大幅度提高了重組酶的表達(dá)效率；80～90年代，通過(guò)基因重組技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，逐漸形成了以理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化策略為主的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。

借助蛋白質(zhì)工程技術(shù)，人們可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用需要改進(jìn)重組酶的性能，使酶制劑得以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用。在洗滌劑用酶的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，經(jīng)常采用理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化相結(jié)合的改性方式來(lái)改善酶的穩(wěn)定性及綜合洗滌效能。目前，洗滌用品工業(yè)中應(yīng)用的商品化酶制劑80%已升級(jí)為性能更加優(yōu)越的蛋白質(zhì)工程突變體。例如，諾維信公司開(kāi)發(fā)的蛋白酶制劑EverlaseTM是SavinaseTM的抗漂白劑突變體；而DurazymTM（諾和諾德公司，丹麥）﹑RelaseTM（諾和諾德公司，丹麥）﹑MaxapemTM（Gist-Brocades，荷蘭）﹑Purafect OxPTM（杰能科公司，美國(guó)）﹑WuxiTM（無(wú)錫聯(lián)合生物制品有限公司，中國(guó)）都是蛋白質(zhì)工程重組酶。此類酶制劑在洗滌用品工業(yè)應(yīng)用所受到的限制較食品行業(yè)少，因而獲得了更為廣泛的認(rèn)可。

2.1 理性設(shè)計(jì)及應(yīng)用

對(duì)于那些三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較清楚的酶分子，可以通過(guò)PCR﹑寡核苷酸盒技術(shù)，對(duì)特定區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行定點(diǎn)突變或進(jìn)行一段序列的置換等理性設(shè)計(jì)，進(jìn)而改變酶蛋白的功能性質(zhì)。理性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的工作量相對(duì)較小，但前提是熟悉酶的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，并需要大量的生物信息學(xué)輔助工作。

關(guān)于蛋白質(zhì)工程的模式酶——枯草芽孢桿菌蛋白酶（Subtilisin），現(xiàn)已有50多種高清晰度的X-ray結(jié)構(gòu)解析模型。結(jié)合同源序列比對(duì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析，確定合適的位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后通過(guò)Kcat/Km﹑溫度穩(wěn)定性﹑pH穩(wěn)定性﹑氧化穩(wěn)定性﹑表面活性劑穩(wěn)定性等方面對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，選擇建立適合突變體的設(shè)計(jì)流程，使得理性設(shè)計(jì)在理論研究的基礎(chǔ)上發(fā)展成為改善酶穩(wěn)定性的捷徑。

根據(jù)酶制劑公司和日化公司發(fā)表的專利技術(shù)總結(jié)，與酶的洗滌穩(wěn)定性相關(guān)的位點(diǎn)修飾包括：將Subtilisin BPN'﹑蛋白酶K﹑Subtilisin Carlsberg疏水區(qū)域的疏水氨基酸Pro129﹑Pro131﹑Ile165﹑Tyr167﹑Tyr171及其臨近的非疏水氨基酸Glu136﹑Gly159﹑Ser164﹑Arg170﹑Ala194﹑Gly195位點(diǎn)替換為更疏水的氨基酸殘基，可以提高酶對(duì)離子強(qiáng)度的穩(wěn)定性，從而使之能耐受硬水洗滌條件；改變金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，采用負(fù)電荷的氨基酸置換Subtilisin鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，如將Subtilisin BPN'﹑Carlsberg﹑DY的Gly131替換為Asp和/或?qū)ro172替換為Asp或Glu，有利于加強(qiáng)鈣離子和結(jié)合位點(diǎn)的靜電吸引，從而提高酶的穩(wěn)定性；置換Subtilisin BPN′未形成二硫鍵的甲硫氨酸Met222，有利于提高酶的抗氧化性和對(duì)漂白劑的耐受性[3]。此外，Acevedo等人通過(guò)對(duì)南極嗜冷細(xì)菌的Subtilisin序列分析和定點(diǎn)突變，證實(shí)284位的丙氨酸對(duì)其嗜低溫性有關(guān)鍵作用，為低溫蛋白酶的定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)提供了有效的理論依據(jù)[4]。

2.2 定向進(jìn)化及應(yīng)用

定向進(jìn)化是在不需要事先了解蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的情況下，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，通過(guò)對(duì)編碼基因的體外隨機(jī)突變﹑重組和定向篩選，獲得具有改進(jìn)功能或全新功能的酶蛋白。體外定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程的新策略，其快速發(fā)展有力地推動(dòng)了生物酶制劑的商業(yè)化開(kāi)發(fā)。定向進(jìn)化以隨機(jī)誘變和體外重組構(gòu)建序列多樣性文庫(kù)為研究基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變方法操作繁瑣，已逐漸為新的體外基因重組技術(shù)所取代。體外重組是基于PCR原理發(fā)展起來(lái)的突變文庫(kù)構(gòu)建方法，包括易錯(cuò)PCR（error PCR）和體外隨機(jī)拼接（DNA shuffling）兩種方案。前者在酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3'～5'校對(duì)功能，以每個(gè)基因2～5個(gè)堿基的替換比率向目的基因中引入突變；后者是將進(jìn)化上相關(guān)的或者獨(dú)立的基因片段重新組合，從而引入大量突變。

21世紀(jì)以來(lái)，研究人員先后開(kāi)發(fā)了序列飽和突變法（sequence saturation Mutagenesis，SeSaM）﹑不依賴于同源性的蛋白質(zhì)重組方法（sequence homology-independent protein recombination，SHIPREC）等20多種改進(jìn)的序列多樣性文庫(kù)構(gòu)建方法，特別是小型但正向突變率較高的突變庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)以及系列由shuffling衍生出的嵌合酶構(gòu)建技術(shù)，克服了傳統(tǒng)定向進(jìn)化策略效率低﹑假陽(yáng)性率高的弊端，加速了定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程。Bryan實(shí)驗(yàn)室通過(guò)易錯(cuò)PCR引入12個(gè)位點(diǎn)突變，獲得了高活性﹑高穩(wěn)定性的蛋白酶復(fù)合進(jìn)化突變體，在比活性沒(méi)有改變的情況下，半衰期提高到原來(lái)的15000倍[5]；Li等人通過(guò)SeSaM定向進(jìn)化方法，對(duì)Subtilisin E進(jìn)行趨化性改造，獲得對(duì)變性劑GdmCl和表面活性劑SDS的耐受性顯著增強(qiáng)的突變體SeSaM1-5（S62I/A153V/G166S/ I205V），該突變體在2% SDS中的半衰期延長(zhǎng)至野生型的27倍[6]；Martinez等則通過(guò)SeSaM隨機(jī)突變和傳統(tǒng)的微孔板篩選法，獲得了在15℃低溫時(shí)酶活提高1.5倍﹑60℃高溫時(shí)半衰期延長(zhǎng)了100倍的蛋白酶突變體MF1，它既可用于低溫型洗衣液，也可用于高溫的餐具洗滌劑[7]。

3．化學(xué)修飾技術(shù)

在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，即酶的化學(xué)修飾。化學(xué)修飾為蛋白側(cè)鏈修飾，作用于蛋白質(zhì)分子的氨基﹑羧基﹑羥基﹑巰基和酰胺鍵等部位。追溯酶化學(xué)修飾的研究歷史，早在20世紀(jì)50年代末就已經(jīng)有人開(kāi)始了關(guān)于酶的化學(xué)修飾技術(shù)的探索，當(dāng)時(shí)主要用來(lái)研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；20世紀(jì)70年代末以后，化學(xué)修飾技術(shù)逐漸向應(yīng)用過(guò)渡?，F(xiàn)有的化學(xué)修飾技術(shù)研究結(jié)果顯示，生物相容性大分子修飾和肽鏈交聯(lián)技術(shù)適合于洗滌劑用酶制劑的穩(wěn)定性改造[8]。

3.1 大分子修飾

大分子修飾是一種利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，進(jìn)而改變酶的理化性質(zhì)與功能的方法。大分子修飾劑本身是多聚電荷體，它能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，并通過(guò)靜電斥力或者空間障礙阻擋抑制劑﹑蛋白酶的接近，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。

淀粉﹑環(huán)糊精﹑聚蔗糖等大分子糖苷經(jīng)過(guò)氧化處理后修飾酶蛋白具有較好的穩(wěn)定作用。聚乙二醇（PEG）既能溶于水又能溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，且其自身沒(méi)有抗原性﹑毒性，生物相容性好，所以已成為日化﹑醫(yī)藥﹑食品領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的大分子修飾劑，既可用于提高生物酶的體外的穩(wěn)定性，又可用于改善生物酶的體內(nèi)穩(wěn)定性。

3.2 蛋白質(zhì)肽鏈交聯(lián)

蛋白質(zhì)肽鏈交聯(lián)指通過(guò)具有兩個(gè)反應(yīng)活性部位的雙功能試劑，在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基間搭橋，形成多肽鏈內(nèi)﹑多肽鏈間或者蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)，而不會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的重大改變。這種方法也稱為蛋白修飾。

雙功能交聯(lián)試劑分為同型交聯(lián)劑和異型交聯(lián)劑。前者主要與胺基反應(yīng)，如戊二醛（PGA）；后者一端與巰基側(cè)鏈作用，另一端與胺基作用，如碳二亞胺（EDC）。其他常用的交聯(lián)劑有羰基二咪唑﹑異氰酸衍生物﹑雙氮聯(lián)苯﹑N,N-聚甲烯雙碘丙酮酰胺和N,N-乙烯雙馬來(lái)酰亞胺等。

采用多反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑修飾可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性。而且酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。Subtilisin Carlsberg通過(guò)PEG修飾和羰基二咪唑交聯(lián)固定，在洗滌劑中半衰期可延長(zhǎng)約2倍[9]。

4．穩(wěn)定劑添加技術(shù)

在含有大量水分的液體洗滌劑中，酶通常更不穩(wěn)定。極性的溶劑﹑緩沖劑以及帶電荷的表面活性劑等組分可能促使儲(chǔ)存過(guò)程中酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)解折疊，而且蛋白酶在水溶液中更容易降解其他生物酶。添加適量穩(wěn)定介質(zhì)以抑制蛋白酶活性﹑調(diào)節(jié)電荷平衡﹑加強(qiáng)滲透保護(hù)，從而保障生物酶結(jié)構(gòu)的剛性是解決液洗用酶穩(wěn)定性的主要技術(shù)方案，即穩(wěn)定劑添加技術(shù)。目前，該技術(shù)的研究重點(diǎn)是開(kāi)發(fā)高效的蛋白酶抑制劑和適合配方的復(fù)合穩(wěn)定體系。

4.1 蛋白酶可逆抑制劑

蛋白酶的可逆抑制劑能夠與蛋白酶的活性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)可逆結(jié)合，它可以使液體酶在貨架期間是穩(wěn)定的﹑無(wú)活性的，而使用時(shí)則以不同方式釋放活性。有機(jī)硼酸鹽作為枯草芽孢桿菌蛋白酶抑制劑，其穩(wěn)定效果因取代基不同而不同，甲基﹑丁基﹑2-環(huán)氧乙烯基硼酸鹽的抑制作用較差，以甲基硼酸鹽效果最弱，芳香基取代的有機(jī)硼酸鹽抑制作用較強(qiáng)。

21世紀(jì)以來(lái)，諾維信公司和寶潔公司都著重開(kāi)發(fā)含芳基的有機(jī)硼酸鹽作為蛋白酶抑制劑，并發(fā)現(xiàn)芳香基團(tuán)-3位與硼酸縮合的有機(jī)硼酸鹽的效果最優(yōu)[10-11]。然而，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果將硼酸鹽確定為第二類生殖毒性化合物，因此人們正積極尋找新的穩(wěn)定劑作為液體洗滌劑中硼酸鹽替代物。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在加入蛋白酶的液體洗滌劑中，α-羥基羧酸鹽對(duì)酶的穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用。特別是含芳香基的羧酸鹽衍生物更有效，使之成為新一代蛋白酶抑制劑的主流產(chǎn)品。諾維信公司近期開(kāi)發(fā)了3-氯苯甲酸﹑4-氯苯甲酸﹑3-氯苯乙酸﹑3,5-二氯苯甲酸﹑3-(3-氯苯基)丙酸等多種帶有芳香基的羧酸鹽衍生物作為枯草芽孢桿菌蛋白酶抑制劑，其最低添加量只有0.001%（w/w），因而可以大大降低配方成本。而且，它較硼酸鹽具有更好的生物降解性[12]。

4.2 復(fù)合穩(wěn)定體系

洗滌劑的表面活性劑組成以及其pH范圍﹑水含量等理化條件，都會(huì)在不同程度上影響蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定作用[2]。因此，需要根據(jù)洗滌劑的配方特點(diǎn)，設(shè)計(jì)蛋白酶抑制劑和小分子添加劑組成的復(fù)合穩(wěn)定體系。其主要設(shè)計(jì)原理是，通過(guò)小分子添加劑2～6元醇降低組合物中的水含量（≤70%），這樣蛋白酶可逆抑制劑才能有效地封閉蛋白酶活性區(qū)。

市售加酶液體洗滌劑的穩(wěn)定體系主要由硼酸鹽（1%～3%）和丙二醇/丙三醇（＞5%）組成，但液體洗滌劑配方中不能配用過(guò)多的陰離子表面活性劑。例如，寶潔公司2009年開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的一款產(chǎn)品，就是由1%～5%硼酸鹽﹑0.1%～7%丙二醇﹑10～50毫摩爾CaCl2.2H2O 組成的穩(wěn)定體系，在40%～70%的水含量條件下，可增強(qiáng)淀粉酶﹑蛋白酶﹑堿性磷酸酯酶等多種生物酶的穩(wěn)定性[13]。

在大量的蛋白酶抑制劑和穩(wěn)定體系開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)上，2012年陶氏化學(xué)公司開(kāi)發(fā)了只添加1～3%等比例混合硼酸鹽和α-羥基單羧酸鹽的酶穩(wěn)定體系，其中α-羥基單羧鹽以乳酸﹑扁桃酸的鈣鹽為佳，硼酸鹽以苯基硼酸鹽為佳。該公司宣稱，這種穩(wěn)定體系在pH2～10范圍內(nèi)對(duì)多種酶濃縮液和洗滌劑廣譜適用[14]?？梢?jiàn)，洗滌配方中酶的穩(wěn)定體系正向著成分簡(jiǎn)化﹑濃度降低，但性能更加高效和廣譜的方向發(fā)展。

5．微囊包載技術(shù)

利用成膜材料（簡(jiǎn)稱壁材），將固體或液體活性物以及易揮發(fā)的原料包裹成大小為1～5000μm的封閉囊，使囊內(nèi)空間與囊外空間隔開(kāi)，統(tǒng)稱為微囊包載技術(shù)。通過(guò)該技術(shù)，可將生物酶與洗滌護(hù)理產(chǎn)品中的破壞性組分進(jìn)行隔離，以保護(hù)酶的生物學(xué)活性。

早期微囊包載酶制劑主要以顆粒酶的形式用于固體洗衣粉。這些顆粒酶由含酶核心結(jié)構(gòu)和包衣層構(gòu)成，制備材料按用途分為成膜劑﹑黏合劑﹑填充劑﹑制粒劑及抑制粉塵的脂肪酸鹽或高級(jí)醇。二十世紀(jì)90年代后，微囊化酶制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域拓展至液體洗滌劑。因此，微囊自身的機(jī)械穩(wěn)定性﹑熱穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性已成為選擇和評(píng)價(jià)液體洗滌劑微囊的重要指標(biāo)。

微囊化研發(fā)過(guò)程中，要根據(jù)包芯性質(zhì)﹑組合物配伍性﹑活性物釋放環(huán)境等具體應(yīng)用條件，選用不同的壁材和制備方法。目前開(kāi)發(fā)的酶微囊，主要以無(wú)機(jī)鹽或聚蔗糖為填充劑或滲透平衡劑，以合成聚合物（聚乙二醇﹑乙烯基聚合物﹑吡咯烷酮聚合物﹑丙烯酸聚合物﹑乙基纖維素聚合物等）或天然大分子化合物（海藻酸（鹽）﹑殼聚糖﹑角叉菜膠﹑黃原膠﹑脂肪酸﹑蠟﹑膨潤(rùn)土等）以及其復(fù)合材料作為包衣。根據(jù)囊壁形成的原理，微囊包載方法可概括為化學(xué)反應(yīng)法﹑物理機(jī)械法﹑物理化學(xué)法三大類，工藝流程分為芯材分散﹑壁材加入﹑壁材沉積及壁材固化四個(gè)主要步驟[15,16]。

5.1 化學(xué)反應(yīng)法

化學(xué)反應(yīng)法微囊包載技術(shù)是指利用單體小分子發(fā)生聚合反應(yīng)，生成高分子成膜材料包覆芯材的微囊制備方法。這種技術(shù)主要包括界面聚合法和原位聚合法。諾維信公司采用原位聚合法開(kāi)發(fā)了一種由環(huán)氧乙烷（EO）﹑環(huán)氧丙烷﹑丙烯酸（EE）或乙烯胺的低分子量聚合體（＞10個(gè)單體）構(gòu)成的二元共聚物（如PEO-40-PEE-37）或三元共聚物（如PEO-40-PEE-74-PEO-40）為主要壁材的微囊，其共聚物組分占微囊的50%～100%（w/w）。此種微囊囊壁既有親水性又有疏水性，既可以包載酶等水溶活性物也可以包載油溶性的香精[17]。

5.2 物理機(jī)械法

指利用機(jī)械或其他物理作用形成囊壁的方法，常用噴霧干燥法﹑氣懸浮成膜法﹑真空蒸發(fā)沉積法﹑包結(jié)絡(luò)合法﹑溶劑蒸發(fā)法﹑擠壓法等。其中，噴霧干燥最適合工業(yè)化批量生產(chǎn)，其主要工藝為：芯材和殼材溶液合并在一起，通過(guò)噴霧干燥或噴霧冷卻技術(shù)進(jìn)行包裹，霧化后的液滴在氣流中干燥或冷卻固化，形成微囊。

二十世紀(jì)90年代是固體洗滌劑和液體洗滌劑市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈的時(shí)期。寶潔公司公開(kāi)了以洗滌助劑沸石為主要填充劑（3～97%），配合具有表面活性的成膜劑（0.1～25%）氧化胺聚合物﹑N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑聚合物或共聚物﹑馬來(lái)酸及丙烯酸聚合物或共聚物共混包埋制備的酶微囊顆粒的專利技術(shù)。利用此項(xiàng)專利技術(shù)制備酶微囊顆粒，不僅適合固體洗滌劑中添加，也是最早開(kāi)發(fā)的適用于液體洗滌劑的微囊[18]。

針對(duì)液體洗滌劑和潮濕環(huán)境酶的穩(wěn)定儲(chǔ)存問(wèn)題，諾維信公司設(shè)計(jì)了一種高持水性微囊顆粒，其水溶性成分＞60%，包括pH＜11的堿金屬或堿土金屬的磷酸鹽﹑亞硫酸鹽﹑硫酸鹽﹑鹽酸鹽﹑碳酸鹽和碳原子數(shù)小于10的有機(jī)酸鹽。其制備工藝為，將含有酶的核心材料在流化床上流化，通過(guò)噴霧將含有水溶性化合物的液體介質(zhì)引入流化床，使非揮發(fā)性化合物沉積在酶核心材料上形成固體包衣，同時(shí)除去液體介質(zhì)。這種微囊充分利用了低分子水溶性化合物的填充效果和吸濕性質(zhì)，既有利于保持高濕環(huán)境中酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，而且可以降低噴霧干燥的能耗[19]。

5.3 物理化學(xué)法

物理化學(xué)法微囊包載技術(shù)主要包括水相聚合法﹑油相聚合法﹑復(fù)相乳液法等?；诰酆衔镪庩?yáng)離子靜電作用將聚電解質(zhì)沉積到酶顆粒上，形成聚電解質(zhì)薄膜的水相聚合方法，是近來(lái)發(fā)展較快的微囊制備方法。寶潔公司以殼聚糖﹑四聚殼聚糖或其混合物為陽(yáng)離子聚合物，海藻酸鹽（甘露糖醛酸單元（M）∶古羅糖醛酸單元（G）＝1.5∶1～4∶1）為陰離子聚合物，開(kāi)發(fā)了可包載酶等多種生物活性物的功能性微囊[20]。制備此微囊時(shí)，將殼聚糖陽(yáng)離子胺基與海藻酸陰離子通過(guò)正負(fù)電荷吸引形成復(fù)合物，溶解度降低，自體系中凝聚形成聚電解質(zhì)半透膜。其顯著優(yōu)點(diǎn)是，制備過(guò)程溫和﹑快捷﹑微囊化的酶活性損失小。這種生物材質(zhì)微囊的刺激性小，具有良好的生物降解性，不僅適用于液體洗滌劑，還被開(kāi)發(fā)用于洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品的活性物添加[16]。

6．應(yīng)用前景展望

中國(guó)洗滌用品工業(yè)“十二五”規(guī)劃綱要中提出了加快產(chǎn)品結(jié)構(gòu)調(diào)整的基本思路，明確要求“加強(qiáng)酶制劑在洗滌劑中的應(yīng)用研究，促進(jìn)加酶洗滌劑產(chǎn)品的發(fā)展，研究用生物酶取代部分化學(xué)品從而減少化學(xué)品的使用和排放”。在西歐﹑日本和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，加酶洗滌劑占洗滌劑市場(chǎng)的80%～95%，在國(guó)內(nèi)加酶洗滌劑所占比例為60%左右。可見(jiàn)，酶制劑在我國(guó)洗滌用品中的應(yīng)用具有廣闊的增長(zhǎng)空間。

采用合理的技術(shù)方法突破酶的穩(wěn)定性限制瓶頸，提高洗滌劑的性價(jià)比，是我國(guó)洗滌用品工業(yè)需要面對(duì)的挑戰(zhàn)。筆者認(rèn)為，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，洗滌劑行業(yè)還應(yīng)在以下四方面加大投入，以取得自主創(chuàng)新的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，提升行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力：

1）蛋白質(zhì)工程技術(shù)和化學(xué)修飾仍是酶制劑穩(wěn)定化的基礎(chǔ)，其有效結(jié)合將提供更具有商業(yè)價(jià)值的酶制劑穩(wěn)定化技術(shù)方案，如在獲悉酶結(jié)構(gòu)﹑功能和理化性質(zhì)等信息的前提下，通過(guò)定向進(jìn)化方法和定點(diǎn)的化學(xué)修飾結(jié)合，開(kāi)發(fā)“雜合型酶”是酶穩(wěn)定化技術(shù)的新熱點(diǎn)；

2）開(kāi)發(fā)新型載體材料是酶微囊包載技術(shù)的研究重點(diǎn)，今后還要在尋找原料易得﹑價(jià)廉﹑生物降解性好﹑低刺激性或者適用范圍廣的材料上尋求微囊技術(shù)廣泛應(yīng)用的突破口；

3）針對(duì)液體洗滌劑的酶穩(wěn)定性改造技術(shù)將更加受到關(guān)注，穩(wěn)定劑添加技術(shù)的應(yīng)用還不能突破洗滌劑含水量和表面活性劑類型的限制，若與微囊包載技術(shù)﹑化學(xué)修飾技術(shù)適度整合，則可能更有效地克服其局限性；

4）配方師不僅要以酶制劑在洗滌劑中的半衰期作為考察指標(biāo)，而且要以洗滌效果為重要參考，根據(jù)使用條件和成本選擇適宜的穩(wěn)定性技術(shù)，對(duì)加酶配方進(jìn)行具體優(yōu)化，以開(kāi)發(fā)更高效的加酶液洗滌劑。

[1] 岳霄(譯).洗滌劑酶的研究及展望[J].中國(guó)洗滌用品工業(yè),2004,3:75-77.

[2] 羅林波,李健玲.影響液體洗滌劑中酶穩(wěn)定性的研究[J].日用化學(xué)品科學(xué),2010,33(6):27-29.

[3] Sierkstra L N,Klugkist J,Markvardsen P,et al.Protease variants and compositions[P].US 20110230386 A1,2011-09-22.

[4] Acevedo J,Rodriguez V,Saavedra M,et al.Cloning,expression and decoding of the cold-adaptation of a newwidely represented thermolabile subtilisin--like protease[J].Journal of Applied Microbiology,2013,114(2):352-363 .

[5] Strausberg S L,Ruan B,Fisher K E,et al.Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin[J].Biochemistry,2005,44:3272-3279.

[6] Li Z,Roccatano D,Lorenz M,et al.Directed evolution of Subtilisin into a highly active and guanidiniumchloride-and sodiumdodecylsulfate--tolerant protease[J].ChemBio Chem,2012,13:691-699.

[7] Martinez R,Jakob F,Tu R,et al.Increasing activity and thermal resistance of bacillus gibsonii alkaline protease (BgAP) by directed evolution[J].Biotechnology and Bioengineering,2013,110(3):711-720.

[8] 徐金庫(kù),張媛媛,劉均洪.酶穩(wěn)定性的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程,2004,3:1-3.

[9] Schroeder M,Lenting H B M,Kandelbauer A,et al.Restricting detergent protease action to surface of protein fibres by chemical modification[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72:738-744.

[10] Nielsen L K,Deane-wray A.4-substitutedphenyl-boronic acids as enzyme stabilizers[P].EP 0832174 B1,2002-05-08.

[11] ELLIOTT R,Phillip,WEISGERBER D,John,SAUNDERS C,Winston.Topical compositions containing enzymes stabilized with inhibitors[P].WO 03041680,2003-05-22.

[12] Nielsen L K,Simonsen O,Werntoft K,et al.Stabilized subtilisin composition[P].US 8071345,2011-12-06.

[13] Kasturi C,Wandstrat ME,Song B X.Liquid detergent composition exhibiting enhanced α-amylase enzyme stability[P].US 7579310,2009-08-25.

[14] Lenoir P M.Enzyme stabilization[P].US 8110539,2012-02-07.

[15] 王培祥,劉云,王濤,等.微膠囊技術(shù)在洗滌劑中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2006,36(4):239-242,250.

[16] 李世忠,劉慧珍.包載技術(shù)及其在化妝品中的應(yīng)用[J].中國(guó)洗滌用品工業(yè),2010,4:63-66.

[17] Callisen T H.Encapsulation of compounds in vesicles[P].EP 1358308B1,2010-01-20.

[18] Wilkinson C P D.BelgiumB.Enzyme granulates[P].US 5783547,1998- 07- 2 1

[19] 馬庫(kù)森 E K.一種新的改進(jìn)的含酶顆粒[P].中國(guó),ZL 99809429.3,2005-03-09.

[20] Boutique J P,Broeckx WA M,Stonehouse J R,et al.Microcapsules[P].US 7960330,2011-06-14.