井趙斌，程積民，2，張寶泉，李紅紅

(1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌712100； 2.中國科學院水利部水土保持研究所，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學資源與環(huán)境學院，陜西 楊凌712100)

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤是原核生物(如古細菌、細菌和放線菌等)和真核生物(原生動物、真菌、藻類和地衣等)棲息的場所。真核生物包括原生生物界、真菌界、植物界和動物界，這些動物、植物、微生物在土壤中各自發(fā)揮著重要的作用。比如，微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，主要扮演著“分解者”的角色，在有機物分解與轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)與利用、土壤肥力形成和溫室氣體產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用，更是地球C、N、P和S等物質(zhì)循環(huán)的“調(diào)節(jié)器”[1]。而真菌影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，在分解植物菌根共生體和病原體中扮演著重要的角色[2]。

近年來，以隨機擴增多態(tài)性(RAPD)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等分子生物學技術(shù)為基礎(chǔ)的方法在土壤真核生物和微生物研究中得到了廣泛的應用，如Gao等[3]利用PCR-RAPD方法對重金屬污染的土壤進行了分析，表明RAPD標記可以作為一個有效評價土壤健康的方法。Naether等[4]利用16S rRNA基因指紋識別方法(末端限制片段長度多態(tài)性T-RFLP和變性梯度凝膠電泳DGGE)對來自德國3個不同地區(qū)草原和森林的土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)進行了分析，結(jié)果表明，草地和森林中酸桿菌門的多樣性差異很大，土壤pH值、有機碳、總氮、C∶N比、磷、硝酸鹽、氨、土壤水分、土壤溫度和土壤呼吸對酸桿菌門群落組成均有顯著影響。但這些方法存在很大的局限性，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數(shù)量約1%或以上的類群能夠被檢測到[5-6]。Roche 454高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為土壤微生物群落多樣性的研究帶來了新的思路，該技術(shù)已在真核生物和土壤微生物研究中有報道。例如Bates等[7]利用454測序平臺對主要古細菌在全球范圍的分布進行了分析，采樣點遍及南、北美洲和南極洲共146個點，發(fā)現(xiàn)土壤C∶N比是唯一與古細菌相對豐度相關(guān)的因子，即低的C∶N比有高的古細菌豐度，其中泉古菌門(Crenarchaeota)是古細菌中的優(yōu)勢菌。Will等[8]利用454測序技術(shù)，對不同土地利用方式下的9個草地土壤細菌V2-V3 16S rRNA基因區(qū)進行了分析，發(fā)現(xiàn)細菌多樣性(H′)與有機碳含量、總氮含量和碳氮比之間呈正相關(guān)性，這種相關(guān)性隨著土層深度的增加而降低。Liu等[9]利用焦磷酸測序技術(shù)分析了飲用水生物膜中的真核生物與細菌群落，認為細菌群落占主要地位。

草地是我國陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，由于氣候變化和人為因素等的影響，我國草地退化嚴重，其中土壤退化是其所面臨的一個主要問題。封育被認為是實現(xiàn)植被自然恢復的有效手段之一[10-11]。目前，國內(nèi)外關(guān)于長期封育對草地地上植被、土壤養(yǎng)分和微生物的影響已有大量的研究[10-14]，但對土壤微生物的研究僅局限于微生物量等方面，測定方法以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主。我國尚未見基于454焦磷酸測序法對草地土壤真核生物多樣性的研究?；诖?，本研究利用454 Roche高通量測序平臺對黃土區(qū)典型草地表層土壤中真核生物進行深度測序，對封育草地土壤真核生物多樣性進行分析，旨在探討454測序技術(shù)在研究草地土壤生物多樣性方面的優(yōu)勢，為該技術(shù)的應用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究區(qū)概況 本研究區(qū)位于云霧山草原自然保護區(qū)，保護區(qū)在寧夏回族自治區(qū)固原市北部45 km (106°24′-106°28′ E，36°13′-36°19′ N)，海拔1 800～2 150 m，處于黃土高原腹地，植被類型為典型草原。本區(qū)為溫帶半干旱區(qū)大陸性氣候，年平均氣溫7.01 ℃；7月氣溫最高22～25 ℃；1月氣溫最低-18～-15 ℃；>0 ℃年積溫2 847～3 592 ℃·d；年日照時長2 300～2 500 h；年降水量425.5 mm，60%～75%的降水集中分布于夏季7-9月；無霜期137 d。保護區(qū)總面積為6 660 hm2，其中包括核心區(qū)(1 000 hm2)、緩沖區(qū)(1 300 hm2)和試驗區(qū)(4 360 hm2)，核心區(qū)內(nèi)設置有不同封育時期的群落類型。經(jīng)2012年全面考察，保護區(qū)內(nèi)共有植物313種，其中栽培植物16種，野生植物297種，主要優(yōu)勢植物有長芒草(Stipabungeana)、大針茅(S.grandis)、百里香(Thymusmongolicus)、鐵桿蒿(Artemisiasacrorum)和星毛委陵菜(Potentillaacaulis)等。

1.2研究方法

1.2.1樣地選擇及土壤樣品采集 于2012年8月中旬，在核心區(qū)選擇不同封育年限(5、9、15、22和30 a)的天然草地群落作為采樣地，同時，在保護區(qū)外圍選擇自由放牧樣地作為對照。在每個樣地上坡、中坡和下坡每隔15 m設置1 m× 1 m的樣方3個。植物樣方調(diào)查結(jié)束后，去除地面枯落物，在每個樣方四個角和中間位置各打一個土鉆(直徑4 cm)混勻作為一個土樣，采樣深度0-20 cm。采集的新鮮土樣快速過1.4 mm的篩后，從9個土壤中各取約10 g快速混勻后用液氮冷凍，帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存，用于微生物群落多樣性分析；剩余下的土樣分成兩部分，一部分放入4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量等測定；另一部分室內(nèi)風干，用于土壤養(yǎng)分和酶活性等測定。

1.2.2土壤理化性質(zhì)測定 土壤有機碳測定采用低溫外加熱重鉻酸鉀氧化-比色法，全氮、全磷含量利用元素分析儀(VARIO EI III CHON，Elmentar，Germany)。土壤速效鉀用NH4OAc提取后，用火焰光度計測定，速效磷用NaHCO3法提取后，用分光光度計測定。

1.2.3土壤總DNA提取 稱取0.5 g研磨成粉末并充分混勻的土壤樣品，使用OMEGA公司的E.Z.N.A Soil DNA抽提試劑盒提取基因組DNA。具體操作步驟參考試劑盒說明書進行，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，所得DNA于-20 ℃保存用于后續(xù)試驗。

1.2.4PCR擴增與454高通量測序 根據(jù)相關(guān)文獻[9,15]選擇V4區(qū)引物3NDf和V4_euk_R2用于真菌18S rRNA分析，其序列為3NDf-5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′、V4_euk_R2-5′-ACGGTATCT(AG) ATC(AG)TCT TCG-3′，該引物序列是帶有“5′454 A、B接頭-特異引物3′”的融合引物，A為測序端，需加標簽，B端引物可以共同。PCR反應體系為20 μL，包括：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng, 用ddH2O補足20 μL。PCR反應條件 95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)。72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

所得PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后用PicoGreenR dsDNA定量試劑盒進行熒光定量，然后按照每個樣品測序量比例混合。樣品送到上海美吉生物公司用454高通量測序儀測序。

1.3數(shù)據(jù)分析與處理 數(shù)據(jù)分析流程主要包括：1)測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與優(yōu)化。首先將測序接頭、Barcode和前引物序列去除后進行有效序列統(tǒng)計分析；然后利用Seqcln檢測接頭和修剪末端，Mothur篩選得到優(yōu)化序列。2)序列分析。利用軟件Mothur經(jīng)與Silva數(shù)據(jù)庫比對，使用UCHIME檢測去除Chimeric序列，最后用Furthest neighbor方法根據(jù)序列相似度的方法將序列聚類生成OUT(Operational Taxonomic Units)。3)生態(tài)學分析。利用Mothur軟件進行多樣性指數(shù)、稀釋曲線、分類學和群落結(jié)構(gòu)組分等分析。

統(tǒng)計分析全部用軟件SPSS 19.0完成。

2 結(jié)果

2.1土壤理化性質(zhì) 隨著封育時間的延長，土壤pH和容重呈下降趨勢；而有機碳、全氮、全磷、速效磷和速效鉀均表現(xiàn)出先增加后降低然后再增加趨勢(表1)。

表1 不同封育時間土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil Physico-chemical properties at different times

2.2測序序列統(tǒng)計 利用454高通量測序，14個樣品共獲得97 684條序列，總堿基數(shù)為41 083 452 bp，序列平均長度420 bp。有效序列數(shù)量及長度分布見表2。經(jīng)優(yōu)化丟棄長度小于200 bp、模糊堿基數(shù)大于0、序列平均質(zhì)量低于25的序列后，14個樣品獲得84 492條序列，總堿基數(shù)36 880 126 bp，平均序列長度436 bp。有效序列和優(yōu)化序列長度分布圖見圖1a和b。

表2 有效序列數(shù)量及長度分布Table 2 The number and Length distribution of valid sequences

2.3多樣性指數(shù) 多樣性指數(shù)分析中用于指數(shù)評估的OTU相似水平常選擇0.03(97%)、0.05(95%)和0.10(90%)。多樣性指數(shù)主要包括豐富度指數(shù)Ace和Chao、多樣性指數(shù)Shannon和Simpson、測序深度指數(shù)Coverage。用Mothur軟件計算的6個樣品(不同封育時期)微生物群落多樣性指數(shù)見表3。在0.03和0.05相似度水平下，各基因稀釋曲線均未趨向平滑，在0.01水平下，稀釋曲線達到明顯的平坦階段(數(shù)據(jù)未列出)。但從Coverage來看，該指數(shù)基本上都超過了90%，說明測序結(jié)果反映了所測樣品中微生物的真實情況。在0.03相似度水平下,從多樣性指數(shù)Shannon可以看出，各群落多樣性大小順序為0 a>5 a>22 a>15 a>30 a>9 a。不同封育時間相關(guān)性分析表明，土壤pH、容重和速效鉀與多樣性指數(shù)Shannon在0.03、0.05和0.01水平下均無顯著相關(guān)性，而有機碳、全氮、全磷、速效磷與多樣性指數(shù)Shannon在0.05水平下均呈顯著負相關(guān)(P<0.01)。

2.4真菌、動物和植物區(qū)系分布 OTU分類學結(jié)果表明，土壤中真菌群落主要由子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、綠藻門(Chlorophyta)、球囊菌門(Glomeromycota)和變形菌門(Proteobacteria)組成。從綱水平來看(圖2)，散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、盤菌綱(Pezizomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、元盤菌綱(Orbiliomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)和變性菌綱(Alphaproteobacteria)是組成真菌群落的主要真菌綱。不同封育時期草地土壤中真菌優(yōu)勢群落在不同分類學水平下差異較大(表4)。

圖1 有效序列和優(yōu)化序列分布圖Fig.1 Length distribution of valid sequences and trimmed sequences

表3 不同封育年限草地土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of microbial community of grasslands with different enclosing years

土壤中動物群落區(qū)系主要包括脊椎動物門(Craniata)、節(jié)足動物門(Arthropoda)、線蟲門(Nematoda)和環(huán)節(jié)動物門(Annelida)。在綱水平上(圖2)，主要包括脊椎動物(Craniata)、有孔蟲界(Rhizaria)、刺嘴綱(Enoplea)、色矛綱(Chromadorea)、絲足蟲類(Cercozoa)、變形蟲(Lobosa)、環(huán)節(jié)動物(Annelida)和六足類(Hexapoda)。不同封育時期草地土壤中不同分類學水平下優(yōu)勢動物區(qū)系見表5。

圖2 不同封育年限真核生物群落結(jié)構(gòu)分析柱狀圖Fig.2 Barplot of eukaryon community of grasslands with different enclosing year

表4 不同封育年限不同分類學水平草地土壤中優(yōu)勢真菌群落Table 4 The dominant fungi community of soil for different taxonomic level at different times

土壤中的主要植物信息包括陸生植物(Embryophyta)和單子葉植物綱(百合綱)(Liliopsida)(圖2)。從物種比對結(jié)果來看，這些植物種主要包括寸苔草(Carexduriuscula)、苔蘚植物(Bryophyta)、蛇床子(Cnidiummonnieri)、蘚生馬先蒿(Pedicularismuscicola)、野甘草屬(Scoparia)、人參屬植物喜馬拉雅人參(Panaxpseudoginsengsubsp.himalaicus)和紫花地丁(Violaphilippica)。

表5 不同封育年限不同分類學水平草地土壤中優(yōu)勢動物群落Table 5 The dominant soil animal communities of grasslands with different enclosing years at different taxonomic level

3 討論

以分子技術(shù)為基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物學研究方法，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因芯片(Microarry)、磷脂脂肪酸圖譜分析(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)和PCR-DGGE/TGGE等極大地推動了土壤生物學研究的深度和廣度。其中運用比較廣泛并被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法，而DGGE/TGGE的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200～900 bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[5]，PCR擴增所需G/C堿基對含量至少達40%，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數(shù)量約1%或以上的類群才能夠通過DGGE檢測到[6]。454焦磷酸測序技術(shù)的最大優(yōu)點是與上述以DNA為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法相比，可以獲得大量土壤中的生物學系統(tǒng)分類信息；另外， 454技術(shù)具有快速和費用低廉的特點，與傳統(tǒng)的Sanger技術(shù)相比，費用可以節(jié)約20～30倍，同時省去了對環(huán)境樣品進行克隆的步驟[16]。研究表明，引物3NDf和V4_euk_R2可以檢測到環(huán)境中大多數(shù)的真核生物(真菌、微型藻類、原生動物、后生動物等)[9,15]，因此，本研究選擇了這兩條引物對真核生物18S rRNA V4區(qū)進行分析。對優(yōu)化序列進行分類學分析時有大量的norank序列，特別是封育30 a草地超過90%的序列屬于norank序列，即在與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對時，無法獲得該序列的分類學信息，因此，我們推斷這些序列可能是一些新發(fā)現(xiàn)的土壤微生物類群。如OBrien等[17]在對混交落葉林中土壤與凋落物微生物研究結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)有12%的序列無法獲得具體物種信息。

生物學分類結(jié)果表明，不同封育時期草地真核生物組成結(jié)構(gòu)和比例不同(圖2、表4)，沒有明顯的線性關(guān)系。隨著封育時間的延長，土壤有機碳、全氮、全磷和速效磷與多樣性指數(shù)Shannon均呈顯著負相關(guān)。已有研究表明，植物通過影響土壤理化性質(zhì)等進一步影響土壤微生物多樣性[18]。隨著封育時間的延長，草地植被物種組成、蓋度和地上生物量等顯著增加，因而產(chǎn)生的大量枯落物對提高土壤養(yǎng)分和增加土壤微生物多樣性發(fā)揮著重要作用；而土壤微生物是土壤有機碳、全氮和全磷等轉(zhuǎn)化和循環(huán)的主要推動力。因此，我們可以推斷，土壤養(yǎng)分和生物多樣性隨著封育時間的延長并不是一個線性相關(guān)的同步過程，應該有一個時間閾值，如果從土壤恢復水平來考慮，在這個閾值點就可以對封育草地進行合理的利用。

真菌主要存在于土壤表層10 cm處，在30 cm以下很難找到。藻類一般生活在土壤表面或者上表層數(shù)毫米處，這些藻類有可能會成為其他微生物的營養(yǎng)源被吞噬。大部分原生動物因為需要濃度相對較高的O2，一般只存在于表層15 cm處，這些原生動物是土壤細菌和藻類的捕食者。因此，本研究中主要采集0-20 cm表層土壤進行了分析。結(jié)果表明，草地真菌主要由子囊菌門、壺菌門、擔子菌門、綠藻門、球囊菌門和變形菌門組成，這與前人[2]對地中海草地真菌群落的研究結(jié)果基本一致，但在科、屬、種分類水平上具有各自的優(yōu)勢菌。

OTU分類結(jié)果表明，優(yōu)化序列中有超過60%的序列分類結(jié)果屬于動物區(qū)系，其中脊椎動物占到了54%。從不同分類學水平可以發(fā)現(xiàn)(表5)，動物區(qū)系以脊椎動物中的鼠兔科居多，這一結(jié)果可為草原動物區(qū)系調(diào)查提供新的研究思路。從圖2可以看出，脊椎動物和有孔蟲界在綱水平上也占了很大比例，從不同分類學水平結(jié)果來看，土壤中多細胞后生動物(尖線蟲)和單細胞原生動物(鞭毛蟲)居多。一般后生動物參與枯枝落葉的破碎和分解過程，使得這些植物殘體有利于微生物的進一步分解，其中線蟲一般又靠取食微生物和其他動物生存。原生動物在土壤中發(fā)揮著參與土壤植物殘體分解和調(diào)節(jié)細菌數(shù)量的作用，其中鞭毛蟲以取食細菌作為食物源。這些動物、植物和微生物在土壤中各自發(fā)揮著重要的作用，構(gòu)成了土壤中一條完整的生物鏈。

為避免土壤樣品中有植物或者枯落物殘留影響測序結(jié)果，在土壤取樣過程中，將表面枯落物和植物去除并過篩。從分類結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有植物基因組信息，主要是陸生植物和單子葉植物綱，表明土壤中存在大量這些植物的根系分解物，這些植物殘體分解物可能是土壤養(yǎng)分和微生物的主要養(yǎng)分庫來源。其中，藻類植物中綠藻門(Chlorophyta)的鏈形植物(Streptophyta)占了很大比例，同時發(fā)現(xiàn)了屬于真核微生物中藻類殼衣藻科的Cephalomonasgranulata。藻類為單細胞或多細胞的真核原生生物，是土壤生物群落的重要組成部分，為土壤有機質(zhì)的最先制造者。通過與云霧山植物區(qū)系調(diào)查結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)有新的植物種，如蛇床子、蘚生馬先蒿和人參屬植物喜馬拉雅人參。這一發(fā)現(xiàn)為研究該地區(qū)原始植被提供了新的思路，例如有些植物種由于草原退化可能已經(jīng)消失，通過這一方法可以還原該地區(qū)原來植物種的分布情況，這可能會對了解黃土高原原始植被組成提供新的信息。

[1] Li R,Khafipour E,Krause D O,etal.Pyrosequencing reveals the influence organic and convertional farming systems on bacterial communities[J].PLoS One,2012,7(12):e51897.doi:10.137/journal.pone.0051897.

[2] Orgiazzi A,Lumini E,Nilsson R H,etal.Unraveling soil fungal communities from different Mediterranean land-use backgrounds[J].PLoS One,2012,7(4):e34847.doi:10.1371/journal.pone.0034847.

[3] Gao Y,Mao L,Miao C Y,etal.Spatial characteristics of soil enzyme activities and microbial community structure under different land uses in Chongming Island,China:Geostatistical modelling and PCR-RAPD method[J].Science of the Total Environment,2010,408:3251-3260.

[4] Naether A,Foesel B U,Naegele V,etal.Environmental factors affect acidobacterial communities below the subgroup level in grassland and forest soils[J].Applied Environmental Microbiology,2012,178(20):7398.DOI:0.1128/AEM.01325-12.

[5] Ferris M J,Muyzer G,Ward D M.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA defined populations inhabiting a hotspring microbial mat community[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62:340-346.

[6] Fromin N,Hamelin J,Tarnawski S,etal.Statistical analysis of denaturing gel electrophoresis (DGE) finger printing patterns[J].Environment Microbiology,2002,4(11):634-643.

[7] Bates S T,Berg-Lyons D,Caporaso J G,etal.Examining the global distribution of dominant archaeal populations in soil[J].The International Society for Microbial Ecology Journal,2011(5):908-917.

[8] Will C,¨rmer A T,Wollherr A,etal.Horizon-specific bacterial community composition of german grassland soils,as revealed by pyrosequencing-based analysis of 16S rRNA genes[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,6751-6759.

[9] Liu R Y,Yu Z S,Guo H G,etal.Pyrosequencing analysis of eukaryotic and bacterial communities in faucet biofims[J].Science of the Total Environment,2012,435-436:124-131.

[10] Jing Z B,Cheng J M,Chen A.Assessment of vegetative ecological characteristics and the succession process during three decades of grazing exclusion in a continental steppe grassland[J].Ecological Engineering,2013,57:162-169.

[11] Zhang J T,Dong Y R.Factors affecting species diversity of plant community and the restoration process in the loess area of China[J].Ecological Engineering,2010,36(3),345-350.

[12] Cheng J,Cheng J M,Hu T M,etal.Dynamic changes ofStipabungeanasteppe species diversity as better indicators for soil quality and sustainable utilization mode in Yunwu Mountain Nature Reserve,Ningxia,China[J].Clean Soil Air Water,2012,40(2):127-133.

[13] Zhan X,Li L,Cheng W.Restoration ofStipakryloviisteppes in Inn Mongolia of China:Assessment of seed banks and vegetation composition[J].Journal of Arid Environment,2007,68:298-307.

[14] Wu G L,Du G Z,Liu Z H,etal.Effect of fencing and grazing onKobresia-dominated meadow in the Qinghai-Tibetan Plateau[J].Plant Soil,2009(3):115-126.

[15] Brate J,Logares R,Berney C,etal.Freshwater Perkinsea and marine-freshwater colonizations revealed by pyrosequencing and phylogeny of environmental rDNA[J].The International Society for Microbial Ecology Journal,2010,4:1144-1153.

[16] Lim Y W,Kim B K,Kim C,etal.Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing[J].The Journal of Microbiology,2010,48(3):284-289.

[17] OBrien H E,Parrent J L,Jaekson J A,etal.Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(9):5544-5550.

[18] 周桔,雷霆.土壤微生物多樣性影響因素及研究方法的現(xiàn)狀與展望[J].生物多樣性,2007,15(3):306-311.