肖驍 字向東等

摘要：為了探討藏山羊低氧生態(tài)適應(yīng)性的分子調(diào)節(jié)機理，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對藏山羊和樂至黑山羊低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）及其受體FLT-1和FLK-1基因的表達量進行測定。結(jié)果表明，在垂體組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flk-1的mRNA相對表達量分別是藏山羊的1.43倍、1.93倍和4.25倍，差異顯著（P<0.05），flt-1的mRNA相對表達量是藏山羊的1.22倍，無顯著差異（P>0.05）；在肝臟組織中，樂至黑山羊hif-1α、vegf165和flt-1的mRNA相對表達量分別是藏山羊的2.08倍、1.52倍和3.21倍，差異顯著（P<0.05），flk-1的mRNA相對表達量是藏山羊的1.17倍，無顯著差異（P>0.05）。說明經(jīng)過長期生物進化和環(huán)境選擇，藏山羊?qū)τ诟咴脱醐h(huán)境已經(jīng)表現(xiàn)出明顯的適應(yīng)性，目的基因的表達量均低于樂至黑山羊。

關(guān)鍵詞：藏山羊；實時熒光定量PCR；mRNA表達量；低氧適應(yīng)性

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2181-04

低氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1， HIF-1）是一種能特異性結(jié)合于促紅細胞生成素基因的低氧反應(yīng)原件（HRE）的DNA結(jié)合蛋白，它廣泛參與動物細胞中缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，是細胞適應(yīng)低氧的重要蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[1]。HIF-1是由對氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達的β亞基組成的異源二聚體[2]。作為HIF-1的調(diào)節(jié)亞基和活性亞基，HIF-1α決定HIF-1的活性，實現(xiàn)HIF-1的生物效應(yīng)。低氧環(huán)境下HIF-1α在組織細胞中廣泛表達，在某些基因的啟動子、增強子或其他調(diào)控區(qū)也都含有HIF-1α的特異結(jié)合序列，這說明在低氧誘導(dǎo)的各種相關(guān)基因的表達中HIF-1α起著關(guān)鍵作用[2]。

血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是對血管形成具有重要作用的生長因子。它是內(nèi)皮細胞特異的絲裂素（Mitogen），能夠促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的活性。根據(jù)VEGF含有氨基酸數(shù)量的不同，可以分為VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206

6種亞型[3，4]。其中VEGF165的生物活性最強、含量最多。VEGF有已知的3種受體：VEGFR-1（Fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT-1），VEGFR-2（Kinase domain region，also referred to as fetal liver kinase，KDR/FLK-1），VEGFR-3（The fms-like tyrosine kinase，F(xiàn)LT-4）[5]。它們均由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)組成。其中VEGFR-1與VEGF的親和力最強，是VEGFR-2的10倍[6，7]。

藏山羊是我國青藏高原的特有畜種，是一個古老的地方山羊品種，迄今為止已有4 000多年的歷史。它主要分布在西藏、四川、青海和甘肅等海拔1 500～5 000 m的高寒牧區(qū)，具有耐粗飼、抗逆性強的特點，能適應(yīng)高原地區(qū)各種嚴酷的自然生態(tài)條件，是藏族同胞重要的生產(chǎn)資料和生活資料[8]。樂至黑山羊是四川省樂至縣經(jīng)過長期選育而成的優(yōu)秀地方品種，主要分布在海拔300～600 m的平原地區(qū)。近年來對與環(huán)境作用相關(guān)的功能基因已有越來越深入的了解，關(guān)于高原物種環(huán)境適應(yīng)性的研究也有一些報道。有研究發(fā)現(xiàn)將對高原低氧、低溫環(huán)境有著極強適應(yīng)能力的高原土著品種藏雞與白來航雞和壽光雞兩個低地品種進行全期模擬低氧孵化，藏雞的孵化率顯著高于兩個低地雞品種，表現(xiàn)出了高度的耐受低氧環(huán)境的能力[9]；將高原鼠兔置于常氧室溫條件下適應(yīng)7 d，Northern雜交檢測hif-1α mRNA在多種組織中均有表達，并且表現(xiàn)出明顯的組織差異性[10]。本實驗旨在通過采用實時熒光定量PCR技術(shù)比較高原藏山羊和平原樂至黑山羊HIF-1α、VEGF165及其受體FLT-1和FLK-1基因的mRNA表達量的差異，進而研究處于高寒低氧地區(qū)動物的環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境因素對其相關(guān)基因表達量的作用及影響，為進一步深入了解環(huán)境因素與基因表達之間的分子機制和調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物 實驗所用的羊只均為健康成年的母山羊，藏山羊來自四川省理縣藏山羊養(yǎng)殖農(nóng)戶；樂至黑山羊購自四川省樂至縣天龍科技示范園。分別采集藏山羊和樂至黑山羊的垂體和肝臟組織樣本，標記后放入液氮中保存。

1.1.2 試劑及耗材 總RNA提取試劑盒、RNA樣品保存液等購自天根生化科技（北京）有限公司；實時熒光定量試劑盒SsoFastTM EvaGreen Supermix、八聯(lián)管及配套管蓋均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；RT Reagents試劑盒、Ex Taq酶、pMD19-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒及耗材均購自美國Axygen公司。

1.2 實驗方法

1.2.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件的一般線性模型程序進行數(shù)據(jù)的分析，采用Pfaffle方法處理數(shù)據(jù)，分析目的基因的相對表達量。不同實驗組中mRNA相對表達量的差異顯著性通過t-檢驗進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA完整性及純度檢測

所提取的藏山羊和樂至黑山羊總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，A260 nm/A280 nm均在1.8～2.0之間，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，18 S RNA和28 S RNA條帶清晰可見（圖1），說明所提取的RNA完整性好，無明顯降解，能滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 實時熒光定量PCR擴增結(jié)果

2.3 目的基因在2個山羊品種間的相對表達量分析

3 小結(jié)與討論

HIF-1α作為缺氧應(yīng)答的調(diào)控因子能夠廣泛激活參與缺氧相關(guān)生理反應(yīng)的眾多基因，是介導(dǎo)缺氧信號與一系列基因的轉(zhuǎn)錄激活的一個重要偶聯(lián)和調(diào)控因子，在缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[19，20]。本實驗通過研究高原羊和平原羊之間受環(huán)境因素調(diào)控的基因表達量的差異，對其環(huán)境適應(yīng)性和基因間的相互作用及影響有了更深入的了解，希望能為今后對組織之間表達量差異以及受體作用機制的進一步研究提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 曲偉棟，趙華強.低氧條件下HIF-1促進血管生成作用的研究進展[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究，2009，25（2）：234-236.

[2] 鄒多宏.低氧誘導(dǎo)因子-1α的研究進展[J]. 國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（1）：320-323.

[3] TONG J P， YAO Y F. Contribution of VEGF and PEDF to choroidal angiogenesis： A need for balanced expressions[J]. Clinical Biochemistry， 2006，39（3）：267-276.

[4] FRANK S，HUBNER G，BREIER G，et al. Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes： Implications for normal and impaired wound healing[J]. The Journal of Biological Chemistry，1995，270（21）：12607-12613.

[5] HOEBEN A， LANDUYT B， HIGHLEY M S， et al. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis[J]. Pharmacological Reviews，2004，56（4）：549-580.

[6] 胡志明，馬 驪，周明乾，等. 大腸桿菌表達的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的復(fù)性與純化研究[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2006，26（8）：1083-1086.

[7] MORERA Y， LAMDAN H， BEQUET M， et al. Biologically active vascular endothelial growth factor as a bacterial recombinant glutathione s-transferase fusion protein[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2006，44（1）：45-53.

[8] 歐陽熙，王 杰，王 永，等. 藏山羊的生態(tài)地理分布及其生態(tài)類型[J]. 西南民族學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），1995，21（3）：264-271.

[9] 王存芳，吳常信，李 寧. 雞缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因的差異表達與低氧適應(yīng)性[J]. 遺傳，2007，29（1）：75-80.

[10] 趙同標，趙新全，常智杰，等. 常氧下高原鼠兔 HIF-1α mRNA的表達[J]. 動物學(xué)研究，2004，25（2）：132-136.

[11] LEE Y K， KIM E-J， LEE J E， et al. Hypoxia induces connective tissue growth factor mRNA expression[J]. Journal of Korean Medical Science， 2009，24（Suppl 1）：S176-S182..

[12] LIU Y V， SEMENZA G L. RACK1 vs. HSP90： Competition for HIF-1α degradation vs. stabilization[J]. Cell Cycle， 2007，6（6）：656-659.

[13] SUTTER C H， LAUGHNER E， SEMENZA G L. Hypoxia-inducible factor 1α protein expression is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2000，97（9）：4748-4753.

[14] 高文祥. 世居高原藏族新生兒臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧誘導(dǎo)因子1α基因及缺氧誘導(dǎo)基因的表達研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2001.

[15] RICHARD D E， BERRA E， POUYSS GUR J. Angiogenesis： How a tumor adapts to hypoxia[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1999，266（3）：718-722.

[16] OSADA-OKA M， IKEDA T， IMAOKA S， et al. VEGF-enhanced proliferation under hypoxia by an autocrine mechanism in human vascular smooth muscle cells[J]. Journal of atherosclerosis and Thrombosis， 2008，15（1）：26-33.

[17] WALTENBERGER J， CLAESSON-WELSH L， SIEGBAHN A， et al. Different signal transduction properties of KDR and FLT1， two receptors for vascular endothelial growth factor[J]. Journal of Biological Chemistry，1994，269（43）：26988-26995.

[18] ZACHARY I. Vascular endothelial growth factor： How it transmits its signal[J]. Experimental Nephrology，1998，6（6）：480-487.

[19] SEMENZA G L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，1999，15（1）：551-578.

[20] SEMENZA G L. Hypoxia-inducible factor 1： Master regulator of O2 homeostasis[J]. Current Opinion in Genetics & Development，1998，8（5）：588-594.