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      碳源對圓酵母(Torula sp.)B84512發(fā)酵合成赤蘚糖醇及副產(chǎn)物甘油的影響*

      2013-05-05 11:28:00高慧竇文芳陸茂林許正宏史勁松
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2013年3期
      關(guān)鍵詞:赤蘚糖醇脫氫酶

      高慧,竇文芳,陸茂林,許正宏,史勁松

      1(江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(江蘇省微生物研究所,江蘇 無錫,214063)

      赤蘚糖醇(1,2,3,4-丁四醇),分子式為 C4H10O4,相對分子質(zhì)量為122.12。自然界中如海藻、蘑菇等、水果類、發(fā)酵食品、微生物中都廣泛存在,由于其口感清涼,且具有低熱量、低吸濕性及高耐受性[1-2]等特點,成為較受追捧的21世紀(jì)功能性食品添加劑。

      國際上均采用微生物發(fā)酵法大批量生產(chǎn)赤蘚糖醇[3-4],葡萄糖、蔗糖、果糖是主要碳源[5]。耐高滲酵母在耗氧條件下以葡萄糖或蔗糖等為碳源時主要通過HMP途徑生成赤蘚糖醇[6-7],即通過磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑產(chǎn)生足夠的還原力,生成大量的赤蘚糖-4-磷酸,而后在赤蘚糖還原酶的作用下脫磷酸生成赤蘚糖醇。代謝途徑如圖1所示,在該途徑中亦可以通過1,6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化為甘油,同時研究表明,甘油也是生產(chǎn)赤蘚糖醇的良好碳源。Waldemar Rymowicz等人[8]以甘油為碳源,發(fā)酵7天赤蘚糖醇的產(chǎn)量為170 g/L,產(chǎn)率為1 g/(L·h)。以甘油為碳源合成赤蘚糖醇的主要代謝途徑是在甘油激酶(Gut1p)作用下催化甘油生成3-磷酸甘油(G3P),再在線粒體中依賴FAD+的3-磷酸甘油脫氫酶(mtGPD)的催化下還原生成磷酸二羥丙酮(DHAP)。磷酸二羥丙酮在磷酸丙糖異構(gòu)酶(pPI)的作用下異構(gòu)化為3-磷酸甘油醛(GA3P)。3-磷酸甘油醛和果糖-1,6-二磷酸相互作用又可以生成木酮糖-5-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸[9-11],繼而脫磷酸生成赤蘚糖醇。

      圖1 酵母體內(nèi)赤蘚糖醇代謝途徑Fig.1 The metabolic of erythritol in yeast

      江蘇省微生物研究所吳燕、楊曉偉等人[12]從土壤中篩選出1株產(chǎn)赤蘚糖醇的耐高滲菌株圓酵母B84512,并對其發(fā)酵過程培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,但只針對不同糖濃度進行了研究,未涉及不同碳源對赤蘚糖醇合成的影響。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,探討圓酵母B84512利用不同碳源及在補料發(fā)酵生成赤蘚糖醇的過程中主要副產(chǎn)物甘油的生成情況。通過對甘油生成與消耗代謝過程中關(guān)鍵酶酶活分析,旨在闡明圓酵母B84512內(nèi)甘油生成途徑,為甘油途徑基因敲除奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 菌株

      圓酵母(Torula)B84512,由江蘇省微生物研究所篩選。

      1.1.2 試劑

      赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸二羥丙酮(DHAP)、DL-α-磷酸甘油為sigma公司標(biāo)準(zhǔn)品,其他均為分析純試劑。

      1.1.3 培養(yǎng)基

      種子培養(yǎng)基:葡萄糖20%,酵母粉1%,尿素0.1%,CuSO4·5H2O 0.001%,MnSO4·H2O 0.001%,pH 6.0。

      固體斜面培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。

      補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 30%,酵母粉1%,尿素 0.1%,CuSO4·5H2O 0.001%,MnSO4·H2O 0.001%,pH 6.0。當(dāng)糖降至20%左右時補加80%葡萄糖至總糖濃度達(dá)到40%、50%及60%。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 菌體培養(yǎng)

      將甘油管保藏菌株接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中,往復(fù)式搖床30℃,200 r/min培養(yǎng)2 d后,用接種環(huán)挑取,1環(huán)菌液在斜面培養(yǎng)基中劃線,30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3 d。挑取新鮮斜面菌株接種于10 mL種子培養(yǎng)基中,30℃,200 r/min培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)1 d后即可用于后續(xù)的發(fā)酵試驗。

      1.2.2 不同碳源發(fā)酵對赤蘚糖醇及甘油的影響

      分別以蔗糖、果糖、山梨醇、葡萄糖和甘油為碳源,按照1.2.1的培養(yǎng)方法進行菌體培養(yǎng),發(fā)酵過程每隔10 h取樣,測定菌濃、殘?zhí)且约俺嗵\糖醇和甘油的量。

      1.2.3 甘油和葡萄糖對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

      以初始濃度為30%的甘油為碳源發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇,按照1.2.1的培養(yǎng)方法進行菌體培養(yǎng),測定甘油的消耗情況和赤蘚糖醇的生成情況,并與葡萄糖為碳源時進行比較。

      1.2.4 發(fā)酵過程補加葡萄糖及補料終濃度對赤蘚糖醇的影響

      以初始濃度為30%葡萄糖為碳源,按照1.2.1的方法培養(yǎng)菌體,當(dāng)葡萄糖濃度降至20%左右補加濃度為80%的葡萄糖使總糖分別達(dá)到40%、50%及60%。發(fā)酵過程中定時取樣,考察對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響及副產(chǎn)物甘油的變化情況。

      1.2.5 用于酶活測定細(xì)胞粗提物的制備

      發(fā)酵液樣品12 000 r/min,4℃,離心10 min收集菌體,用預(yù)冷的滲透壓相同的破壁緩沖液洗滌1次,再重懸于破壁緩沖液(100 mmol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液,含 1 mmol/L DTT,2 mmol/L MgCl2)中,稱取等量的濕菌體按質(zhì)量比為(1∶8)~(1∶10)的比例用破壁緩沖液懸浮,4℃超聲破碎(工作3 s,間隔6 s)2 h,未破碎的細(xì)胞于4℃,10 000 r/min離心20 min去除,上清液即為用于酶活測定的粗酶提取物。

      1.2.6 胞漿3-磷酸甘油脫氫酶酶活測定

      反應(yīng)體系包括20 mmol/L、pH 7.0咪唑-HCl緩沖液、1mmol/L DTT、1mmol/L MgCl2、0.09 mmol/L NADH和0.67 mmol/L DHAP組成,30℃反應(yīng)1 min后,以加入DHAP為0時,線性范圍為5 min,340 nm處測定30 s和120 s時吸光度。定義:30℃下1 min消耗1 μmol/L NADH所需的酶量為1個酶活單位(U)。

      1.2.7 3-磷酸甘油酯酶酶活測定

      取酶液50 μL加入0.2 mol/L DL-α磷酸甘油10 μL,1 mol/L、pH 7.0 咪唑 10 μL,0.25 mol/L MgCl210 μL,再加入 20 μL 超純水,使總體積為 0.1 mL。30℃水浴反應(yīng)至所需時間后加入2 mL 5%三氯乙酸終止反應(yīng),振蕩并于10 000 r/min離心10 min,取上清液測定無機磷含量。在30℃,pH 7.0條件下,每分鐘催化3-磷酸甘油生成1 μmol磷酸根所需的酶量為1個酶活單位(U)。

      1.2.8 線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活測定

      反應(yīng)體系組成為:0.5 mol/L、pH 7.6 Tris,0.05 mol/L DL-α-磷酸甘油,1 mg/mL MTT,1 mg/mL PMS。酶促反應(yīng)溫度為30℃。在550 nm處測定MTT還原產(chǎn)物,用8.1×103M-1cm-1摩爾消光系數(shù)來計算底物轉(zhuǎn)化速率。將1 min還原1 μmol MTT定義為1個酶活單位(U)。

      1.3 分析方法

      1.3.1 發(fā)酵液中赤蘚糖醇和甘油的HPLC測定

      色譜條件:色譜柱為Alltech Prevail Carbohydrate ES(4.6 mm × 250 mm,5 μm),流動相為乙腈∶水(75∶25);流速為1.0 mL/min;RI 2000型示差折光檢測器;柱溫為30℃。

      1.3.2 發(fā)酵液中葡萄糖的測定

      3,5-二硝基水楊酸法。

      1.3.3 菌體生物量測定

      將樣品稀釋至合適濃度后在600 nm處測定紫外吸收值。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 不同碳源發(fā)酵對赤蘚糖醇和甘油產(chǎn)量的影響

      如圖2-A所示,葡萄糖為碳源,赤蘚糖醇產(chǎn)量最高,為115 g/L;其次為果糖和蔗糖,赤蘚糖醇產(chǎn)量為83 g/L和71 g/L;以山梨醇為碳源,赤蘚糖醇產(chǎn)量最低,僅為28 g/L。此外,發(fā)酵過程中都伴隨著副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生。從圖2-B可以看出,發(fā)酵初期至中期甘油不斷積聚,以葡萄糖和果糖為碳源時,甘油的產(chǎn)量最高,分別達(dá)到54 g/L和52 g/L;以蔗糖、山梨醇及甘露糖為碳源時,甘油的產(chǎn)量較少,分別為22 g/L、21 g/L及25 g/L??梢钥闯?,葡萄糖為圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的最適碳源,蔗糖、果糖次之,山梨醇最差。但任何碳源在發(fā)酵過程中均會產(chǎn)生甘油,且在發(fā)酵中后期甘油逐漸被消耗,推測甘油極有可能被作為碳源用于合成赤蘚糖醇,故研究圓酵母B84512發(fā)酵生成赤蘚糖醇的過程中甘油的生成情況十分必要。

      圖2 不同碳源對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇及甘油影響Fig.2 The production of erythritol and glycerol with different carbon hydrate

      2.2 甘油和葡萄糖對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

      在上述研究的基礎(chǔ)上,比較了甘油和葡萄糖作為碳源對圓酵母B84512發(fā)酵生成赤蘚糖醇的影響。從表1可以看出,以甘油為碳源時碳源的消耗速率及赤蘚糖醇的生成速率分別為1.58 g/(L·h)和0.61 g/(L·h),而以葡萄糖為碳源時碳源消耗速率為3.33 g/(L·h),赤蘚糖醇的生成速率為0.96 g/(L·h)。且以葡萄糖為碳源時赤蘚糖醇的得率也較甘油高。因此,圓酵母B84512以葡萄糖為碳源合成赤蘚糖醇的效率明顯優(yōu)于甘油。

      表1 甘油和葡萄糖為碳源對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇情況比較Table 1 Comparison of erythritol fermentation performance by different carbon sources such as glycerol and glucose

      2.3 葡萄糖補加對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

      以前期研究為基礎(chǔ),嘗試通過發(fā)酵過程中補加葡萄糖,以增加赤蘚糖醇的產(chǎn)量并減少主要代謝副產(chǎn)物甘油的生成??刂品峙a料發(fā)酵的初始葡萄糖濃度為30%,當(dāng)葡萄糖濃度降低至20%左右補加葡萄糖,補料至不同終糖濃度發(fā)酵過程比較如圖3所示(包括葡萄糖消耗、菌濃、赤蘚糖醇生成及甘油變化)??偺菫?0%時發(fā)酵250 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到225 g/L,產(chǎn)率為0.9 g/(L·h)。終糖濃度為50%時發(fā)酵260 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高到了253 g/L,產(chǎn)率為1.03 g/(L·h)。而補加葡萄糖至終濃度為60%是赤蘚糖醇產(chǎn)量僅為230 g/L,產(chǎn)率為0.85 g/(L·h)(圖3-A中箭頭所指方向為流加葡萄糖點)。

      發(fā)酵過程中補料并不能抑制甘油的生成,反而與葡萄糖濃度呈正相關(guān)。葡萄糖終濃度為40%時甘油的產(chǎn)量最高可達(dá)到102 g/L,葡萄糖終濃度為50%和60%時甘油產(chǎn)量分別達(dá)到145 g/L和189 g/L。但如圖D所示,發(fā)酵中后期葡萄糖被消耗完,甘油量逐步降低,赤蘚糖醇產(chǎn)量持續(xù)增長。以甘油為碳源合成赤蘚糖醇的速率較分別為0.86 g/(L·h)、0.95 g/(L·h)和0.73 g/(L·h),均低于以葡萄糖為碳源時赤蘚糖醇的合成速率。此外,由于甘油的合成及分解代謝導(dǎo)致發(fā)酵周期延長,因此必須阻斷甘油合成途徑的關(guān)鍵酶以提高赤蘚糖醇的產(chǎn)率。

      圖3 不同補料終濃度對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇及甘油過程比較Fig.3 Comparison of erythritol fermentation performance by feding-batch glucose to different concentration

      2.4 發(fā)酵過程中胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活表征

      通過測定胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活以確定甘油合成途徑關(guān)鍵酶,以驗證文獻報道[11]的甘油合成及分解途徑是否適用于圓酵母B84512。從表2可以看出,在整個甘油發(fā)酵過程中,圓酵母B84512皆具有較高的ctGPD酶活并在80 h時出現(xiàn)酶活峰值;發(fā)酵過程中80 h內(nèi)一直積累甘油,100 h后甘油開始消耗,ctGPD也進入低水平階段。而在80 h內(nèi),GPP的酶活一直處于高水平,也在80 h出現(xiàn)峰值。這一特征與圓酵母B84512以最高速率積累甘油在時間上吻合。在發(fā)酵過程中細(xì)胞中的GPP活性遠(yuǎn)高于ctGPD,顯然,在由葡萄糖分解形成磷酸二羥丙酮,再在ctGPD的催化下還原為3-磷酸甘油,而后在GPP的催化下水解生成甘油的代謝途徑中,ctGPD成為圓酵母B84512甘油合成的限速酶,ctGPD的活力水平?jīng)Q定了甘油的合成和積累水平。

      表2 甘油合成與消耗關(guān)鍵酶活力與甘油生成消耗速率及葡萄糖消耗關(guān)系Table 2 Specific activities of key enzyme and specific rate of glycerol and glucose formation and consumption in Torula sp.B84512

      從表2可以看出,圓酵母B84512在甘油發(fā)酵的早期及中期幾乎無mtGPD酶活或酶活很低,糖濃度降至40 g/L以下mtGPD酶活迅速增加,此時mtGPD開始被誘導(dǎo)。隨著mtGPD的誘導(dǎo),發(fā)酵液中的甘油含量開始下降,到發(fā)酵末期甘油消耗完畢,mtGPD酶活已經(jīng)很低。mtGPD在葡萄糖存在時受到葡萄糖代謝過程中1,6-二磷酸果糖的抑制,而甘油則能誘導(dǎo)它的表達(dá)。100 h mtGPD酶活增加說明甘油開始大量向磷酸二羥丙酮方向生成,繼而生成赤蘚糖醇。

      3 討論

      對圓酵母B84512的發(fā)酵過程研究結(jié)果如下:葡萄糖是產(chǎn)赤蘚糖醇的最佳碳源。發(fā)酵過程中補加葡萄糖至終濃度為50%,赤蘚糖醇的產(chǎn)量最高,發(fā)酵260 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量為253 g/L,產(chǎn)率為1.03 g/(L·h)。此外,發(fā)酵過程中伴隨著副產(chǎn)物甘油的生成,通過對甘油合成代謝及分解代謝過程中關(guān)鍵酶包括胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵80 h內(nèi)ctGPD及Gpp酶活持續(xù)增加且均在80 h達(dá)到峰值,這與80 h時甘油達(dá)到最高積累速率相符合。而在80 h內(nèi)mtGPD酶活一直較低,受到1,6-二磷酸果糖的抑制,直到葡萄糖濃度降至40 g/L時才被甘油誘導(dǎo)。甘油在甘油激酶及線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的作用下生成磷酸二羥丙酮,而后生成赤蘚糖醇。

      雖然甘油可以再次分解生成赤蘚糖醇,但大大地延長了發(fā)酵時間,這在工業(yè)生產(chǎn)中是不經(jīng)濟的。在合成甘油的代謝支路中,胞漿3-磷酸甘油脫氫酶(ctGPD)是合成途徑中關(guān)鍵酶。因此,下一步計劃對該酶進行基因敲除,減弱向甘油合成途徑的流量,縮短發(fā)酵周期,增加赤蘚糖醇的生成速率。

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