高慧，竇文芳，陸茂林，許正宏，史勁松

1(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江蘇省微生物研究所，江蘇 無錫，214063)

赤蘚糖醇(1，2，3，4-丁四醇)，分子式為 C4H10O4，相對分子質(zhì)量為122.12。自然界中如海藻、蘑菇等、水果類、發(fā)酵食品、微生物中都廣泛存在，由于其口感清涼，且具有低熱量、低吸濕性及高耐受性［1－2］等特點，成為較受追捧的21世紀(jì)功能性食品添加劑。

國際上均采用微生物發(fā)酵法大批量生產(chǎn)赤蘚糖醇［3－4］，葡萄糖、蔗糖、果糖是主要碳源［5］。耐高滲酵母在耗氧條件下以葡萄糖或蔗糖等為碳源時主要通過HMP途徑生成赤蘚糖醇［6－7］，即通過磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑產(chǎn)生足夠的還原力，生成大量的赤蘚糖-4-磷酸，而后在赤蘚糖還原酶的作用下脫磷酸生成赤蘚糖醇。代謝途徑如圖1所示，在該途徑中亦可以通過1，6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化為甘油，同時研究表明，甘油也是生產(chǎn)赤蘚糖醇的良好碳源。Waldemar Rymowicz等人［8］以甘油為碳源，發(fā)酵7天赤蘚糖醇的產(chǎn)量為170 g/L，產(chǎn)率為1 g/(L·h)。以甘油為碳源合成赤蘚糖醇的主要代謝途徑是在甘油激酶(Gut1p)作用下催化甘油生成3-磷酸甘油(G3P)，再在線粒體中依賴FAD+的3-磷酸甘油脫氫酶(mtGPD)的催化下還原生成磷酸二羥丙酮(DHAP)。磷酸二羥丙酮在磷酸丙糖異構(gòu)酶(pPI)的作用下異構(gòu)化為3-磷酸甘油醛(GA3P)。3-磷酸甘油醛和果糖-1，6-二磷酸相互作用又可以生成木酮糖-5-磷酸和赤蘚糖-4-磷酸［9－11］，繼而脫磷酸生成赤蘚糖醇。

圖1 酵母體內(nèi)赤蘚糖醇代謝途徑Fig.1 The metabolic of erythritol in yeast

江蘇省微生物研究所吳燕、楊曉偉等人［12］從土壤中篩選出1株產(chǎn)赤蘚糖醇的耐高滲菌株圓酵母B84512，并對其發(fā)酵過程培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，但只針對不同糖濃度進行了研究，未涉及不同碳源對赤蘚糖醇合成的影響。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，探討圓酵母B84512利用不同碳源及在補料發(fā)酵生成赤蘚糖醇的過程中主要副產(chǎn)物甘油的生成情況。通過對甘油生成與消耗代謝過程中關(guān)鍵酶酶活分析，旨在闡明圓酵母B84512內(nèi)甘油生成途徑，為甘油途徑基因敲除奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

圓酵母(Torula)B84512，由江蘇省微生物研究所篩選。

1.1.2 試劑

赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸二羥丙酮(DHAP)、DL-α-磷酸甘油為sigma公司標(biāo)準(zhǔn)品，其他均為分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20%，酵母粉1%，尿素0.1%，CuSO4·5H2O 0.001%，MnSO4·H2O 0.001%，pH 6.0。

固體斜面培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。

補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 30%，酵母粉1%，尿素 0.1%，CuSO4·5H2O 0.001%，MnSO4·H2O 0.001%，pH 6.0。當(dāng)糖降至20%左右時補加80%葡萄糖至總糖濃度達(dá)到40%、50%及60%。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)

將甘油管保藏菌株接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，往復(fù)式搖床30℃，200 r/min培養(yǎng)2 d后，用接種環(huán)挑取，1環(huán)菌液在斜面培養(yǎng)基中劃線，30℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3 d。挑取新鮮斜面菌株接種于10 mL種子培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后即可用于后續(xù)的發(fā)酵試驗。

1.2.2 不同碳源發(fā)酵對赤蘚糖醇及甘油的影響

分別以蔗糖、果糖、山梨醇、葡萄糖和甘油為碳源，按照1.2.1的培養(yǎng)方法進行菌體培養(yǎng)，發(fā)酵過程每隔10 h取樣，測定菌濃、殘?zhí)且约俺嗵\糖醇和甘油的量。

1.2.3 甘油和葡萄糖對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

以初始濃度為30%的甘油為碳源發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇，按照1.2.1的培養(yǎng)方法進行菌體培養(yǎng)，測定甘油的消耗情況和赤蘚糖醇的生成情況，并與葡萄糖為碳源時進行比較。

1.2.4 發(fā)酵過程補加葡萄糖及補料終濃度對赤蘚糖醇的影響

以初始濃度為30%葡萄糖為碳源，按照1.2.1的方法培養(yǎng)菌體，當(dāng)葡萄糖濃度降至20%左右補加濃度為80%的葡萄糖使總糖分別達(dá)到40%、50%及60%。發(fā)酵過程中定時取樣，考察對赤蘚糖醇產(chǎn)量的影響及副產(chǎn)物甘油的變化情況。

1.2.5 用于酶活測定細(xì)胞粗提物的制備

發(fā)酵液樣品12 000 r/min，4℃，離心10 min收集菌體，用預(yù)冷的滲透壓相同的破壁緩沖液洗滌1次，再重懸于破壁緩沖液(100 mmol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液，含 1 mmol/L DTT，2 mmol/L MgCl2)中，稱取等量的濕菌體按質(zhì)量比為(1∶8)～(1∶10)的比例用破壁緩沖液懸浮，4℃超聲破碎(工作3 s，間隔6 s)2 h，未破碎的細(xì)胞于4℃，10 000 r/min離心20 min去除，上清液即為用于酶活測定的粗酶提取物。

1.2.6 胞漿3-磷酸甘油脫氫酶酶活測定

反應(yīng)體系包括20 mmol/L、pH 7.0咪唑-HCl緩沖液、1mmol/L DTT、1mmol/L MgCl2、0.09 mmol/L NADH和0.67 mmol/L DHAP組成，30℃反應(yīng)1 min后，以加入DHAP為0時，線性范圍為5 min，340 nm處測定30 s和120 s時吸光度。定義:30℃下1 min消耗1 μmol/L NADH所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.7 3-磷酸甘油酯酶酶活測定

取酶液50 μL加入0.2 mol/L DL-α磷酸甘油10 μL，1 mol/L、pH 7.0 咪唑 10 μL，0.25 mol/L MgCl210 μL，再加入 20 μL 超純水，使總體積為 0.1 mL。30℃水浴反應(yīng)至所需時間后加入2 mL 5%三氯乙酸終止反應(yīng)，振蕩并于10 000 r/min離心10 min，取上清液測定無機磷含量。在30℃，pH 7.0條件下，每分鐘催化3-磷酸甘油生成1 μmol磷酸根所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.8 線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活測定

反應(yīng)體系組成為:0.5 mol/L、pH 7.6 Tris，0.05 mol/L DL-α-磷酸甘油，1 mg/mL MTT，1 mg/mL PMS。酶促反應(yīng)溫度為30℃。在550 nm處測定MTT還原產(chǎn)物，用8.1×103M－1cm－1摩爾消光系數(shù)來計算底物轉(zhuǎn)化速率。將1 min還原1 μmol MTT定義為1個酶活單位(U)。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液中赤蘚糖醇和甘油的HPLC測定

色譜條件:色譜柱為Alltech Prevail Carbohydrate ES(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶水(75∶25);流速為1.0 mL/min;RI 2000型示差折光檢測器;柱溫為30℃。

1.3.2 發(fā)酵液中葡萄糖的測定

3，5-二硝基水楊酸法。

1.3.3 菌體生物量測定

將樣品稀釋至合適濃度后在600 nm處測定紫外吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源發(fā)酵對赤蘚糖醇和甘油產(chǎn)量的影響

如圖2－A所示，葡萄糖為碳源，赤蘚糖醇產(chǎn)量最高，為115 g/L;其次為果糖和蔗糖，赤蘚糖醇產(chǎn)量為83 g/L和71 g/L;以山梨醇為碳源，赤蘚糖醇產(chǎn)量最低，僅為28 g/L。此外，發(fā)酵過程中都伴隨著副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)生。從圖2－B可以看出，發(fā)酵初期至中期甘油不斷積聚，以葡萄糖和果糖為碳源時，甘油的產(chǎn)量最高，分別達(dá)到54 g/L和52 g/L;以蔗糖、山梨醇及甘露糖為碳源時，甘油的產(chǎn)量較少，分別為22 g/L、21 g/L及25 g/L?？梢钥闯?，葡萄糖為圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇的最適碳源，蔗糖、果糖次之，山梨醇最差。但任何碳源在發(fā)酵過程中均會產(chǎn)生甘油，且在發(fā)酵中后期甘油逐漸被消耗，推測甘油極有可能被作為碳源用于合成赤蘚糖醇，故研究圓酵母B84512發(fā)酵生成赤蘚糖醇的過程中甘油的生成情況十分必要。

圖2 不同碳源對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇及甘油影響Fig.2 The production of erythritol and glycerol with different carbon hydrate

2.2 甘油和葡萄糖對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

在上述研究的基礎(chǔ)上，比較了甘油和葡萄糖作為碳源對圓酵母B84512發(fā)酵生成赤蘚糖醇的影響。從表1可以看出，以甘油為碳源時碳源的消耗速率及赤蘚糖醇的生成速率分別為1.58 g/(L·h)和0.61 g/(L·h)，而以葡萄糖為碳源時碳源消耗速率為3.33 g/(L·h)，赤蘚糖醇的生成速率為0.96 g/(L·h)。且以葡萄糖為碳源時赤蘚糖醇的得率也較甘油高。因此，圓酵母B84512以葡萄糖為碳源合成赤蘚糖醇的效率明顯優(yōu)于甘油。

表1 甘油和葡萄糖為碳源對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇情況比較Table 1 Comparison of erythritol fermentation performance by different carbon sources such as glycerol and glucose

2.3 葡萄糖補加對圓酵母B84512合成赤蘚糖醇及甘油的影響

以前期研究為基礎(chǔ)，嘗試通過發(fā)酵過程中補加葡萄糖，以增加赤蘚糖醇的產(chǎn)量并減少主要代謝副產(chǎn)物甘油的生成?？刂品峙a料發(fā)酵的初始葡萄糖濃度為30%，當(dāng)葡萄糖濃度降低至20%左右補加葡萄糖，補料至不同終糖濃度發(fā)酵過程比較如圖3所示(包括葡萄糖消耗、菌濃、赤蘚糖醇生成及甘油變化)?？偺菫?0%時發(fā)酵250 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量達(dá)到225 g/L，產(chǎn)率為0.9 g/(L·h)。終糖濃度為50%時發(fā)酵260 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量提高到了253 g/L，產(chǎn)率為1.03 g/(L·h)。而補加葡萄糖至終濃度為60%是赤蘚糖醇產(chǎn)量僅為230 g/L，產(chǎn)率為0.85 g/(L·h)(圖3－A中箭頭所指方向為流加葡萄糖點)。

發(fā)酵過程中補料并不能抑制甘油的生成，反而與葡萄糖濃度呈正相關(guān)。葡萄糖終濃度為40%時甘油的產(chǎn)量最高可達(dá)到102 g/L，葡萄糖終濃度為50%和60%時甘油產(chǎn)量分別達(dá)到145 g/L和189 g/L。但如圖D所示，發(fā)酵中后期葡萄糖被消耗完，甘油量逐步降低，赤蘚糖醇產(chǎn)量持續(xù)增長。以甘油為碳源合成赤蘚糖醇的速率較分別為0.86 g/(L·h)、0.95 g/(L·h)和0.73 g/(L·h)，均低于以葡萄糖為碳源時赤蘚糖醇的合成速率。此外，由于甘油的合成及分解代謝導(dǎo)致發(fā)酵周期延長，因此必須阻斷甘油合成途徑的關(guān)鍵酶以提高赤蘚糖醇的產(chǎn)率。

圖3 不同補料終濃度對圓酵母B84512發(fā)酵產(chǎn)赤蘚糖醇及甘油過程比較Fig.3 Comparison of erythritol fermentation performance by feding-batch glucose to different concentration

2.4 發(fā)酵過程中胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活表征

通過測定胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活以確定甘油合成途徑關(guān)鍵酶，以驗證文獻報道［11］的甘油合成及分解途徑是否適用于圓酵母B84512。從表2可以看出，在整個甘油發(fā)酵過程中，圓酵母B84512皆具有較高的ctGPD酶活并在80 h時出現(xiàn)酶活峰值;發(fā)酵過程中80 h內(nèi)一直積累甘油，100 h后甘油開始消耗，ctGPD也進入低水平階段。而在80 h內(nèi)，GPP的酶活一直處于高水平，也在80 h出現(xiàn)峰值。這一特征與圓酵母B84512以最高速率積累甘油在時間上吻合。在發(fā)酵過程中細(xì)胞中的GPP活性遠(yuǎn)高于ctGPD，顯然，在由葡萄糖分解形成磷酸二羥丙酮，再在ctGPD的催化下還原為3-磷酸甘油，而后在GPP的催化下水解生成甘油的代謝途徑中，ctGPD成為圓酵母B84512甘油合成的限速酶，ctGPD的活力水平?jīng)Q定了甘油的合成和積累水平。

表2 甘油合成與消耗關(guān)鍵酶活力與甘油生成消耗速率及葡萄糖消耗關(guān)系Table 2 Specific activities of key enzyme and specific rate of glycerol and glucose formation and consumption in Torula sp.B84512

從表2可以看出，圓酵母B84512在甘油發(fā)酵的早期及中期幾乎無mtGPD酶活或酶活很低，糖濃度降至40 g/L以下mtGPD酶活迅速增加，此時mtGPD開始被誘導(dǎo)。隨著mtGPD的誘導(dǎo)，發(fā)酵液中的甘油含量開始下降，到發(fā)酵末期甘油消耗完畢，mtGPD酶活已經(jīng)很低。mtGPD在葡萄糖存在時受到葡萄糖代謝過程中1，6-二磷酸果糖的抑制，而甘油則能誘導(dǎo)它的表達(dá)。100 h mtGPD酶活增加說明甘油開始大量向磷酸二羥丙酮方向生成，繼而生成赤蘚糖醇。

3 討論

對圓酵母B84512的發(fā)酵過程研究結(jié)果如下:葡萄糖是產(chǎn)赤蘚糖醇的最佳碳源。發(fā)酵過程中補加葡萄糖至終濃度為50%，赤蘚糖醇的產(chǎn)量最高，發(fā)酵260 h赤蘚糖醇的產(chǎn)量為253 g/L，產(chǎn)率為1.03 g/(L·h)。此外，發(fā)酵過程中伴隨著副產(chǎn)物甘油的生成，通過對甘油合成代謝及分解代謝過程中關(guān)鍵酶包括胞漿3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油酯酶和線粒體3-磷酸甘油脫氫酶酶活分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵80 h內(nèi)ctGPD及Gpp酶活持續(xù)增加且均在80 h達(dá)到峰值，這與80 h時甘油達(dá)到最高積累速率相符合。而在80 h內(nèi)mtGPD酶活一直較低，受到1，6-二磷酸果糖的抑制，直到葡萄糖濃度降至40 g/L時才被甘油誘導(dǎo)。甘油在甘油激酶及線粒體3-磷酸甘油脫氫酶的作用下生成磷酸二羥丙酮，而后生成赤蘚糖醇。

雖然甘油可以再次分解生成赤蘚糖醇，但大大地延長了發(fā)酵時間，這在工業(yè)生產(chǎn)中是不經(jīng)濟的。在合成甘油的代謝支路中，胞漿3-磷酸甘油脫氫酶(ctGPD)是合成途徑中關(guān)鍵酶。因此，下一步計劃對該酶進行基因敲除，減弱向甘油合成途徑的流量，縮短發(fā)酵周期，增加赤蘚糖醇的生成速率。

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