刁春英，畢陽，李永才

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050061）

蘋果梨（Pyrus bretschneideri Rehd）是甘肅省特產(chǎn)水果，品質(zhì)極佳，在國內(nèi)外市場(chǎng)頗具聲譽(yù)。但其果實(shí)極易遭受互隔交鏈孢（Alternaria alternata）的侵染而發(fā)生黑斑病，貯藏期間的發(fā)病率可高達(dá)37%[1]，造成了明顯的腐爛損失。因此，生產(chǎn)中亟待找到控制該病的方法。

雖然化學(xué)殺菌劑可有效控制果蔬腐爛，但由于殺菌劑殘留，環(huán)境污染及誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性等問題而逐漸受到限制。因此，近年來人們致力于發(fā)展新的、可替代化學(xué)殺菌劑的更為安全的方法。殼聚糖是幾丁質(zhì)分子脫去乙酰基的衍生物，其來源豐富，價(jià)格低廉無毒、副作用，可用于果蔬的防腐保鮮[2－3]。據(jù)報(bào)道，殼聚糖處理明顯減少了草莓灰霉病[4]、臍橙青霉病[5]、桃軟腐病和褐腐病[6－7]杏黑斑病[8]的發(fā)病率。

本研究在殼聚糖控制蘋果梨黑斑病的基礎(chǔ)上，探索殼聚糖處理后果皮抗菌物質(zhì)及病程相關(guān)蛋白的變化，以豐富和完善殼聚糖的抗菌機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

供試蘋果梨10月3日采自甘肅省景泰縣條山農(nóng)場(chǎng)，單果包紙后，裝箱運(yùn)抵本校，在 0℃，RH（85±5）%[1]下貯藏待用。供試互隔交鏈孢（A.alternata）參照方中達(dá)法[9]分離自腐爛病果，純化后在PDA上保存待用。供試殼聚糖由浙江大學(xué)化工系提供。

超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司；高壓滅菌鍋：北京廣順科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；色質(zhì)聯(lián)用儀（HP GC6890－MS5973）：美國惠譜公司；冷凍高速離心機(jī)：德國Sigma（五洲東方）；UV－2450型紫外－可見分光光度計(jì)：日本島津。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖采后處理

取健康、表面光滑、表面無任何損傷、大小一致的果實(shí)，先用自來水進(jìn)行表面沖洗，自然晾干后在3%的殼聚糖溶液中進(jìn)行浸泡處理1 min，晾干后用于抗菌物質(zhì)的測(cè)定，以未經(jīng)任何處理者為對(duì)照。2%殼聚糖浸泡處理和0.75%殼聚糖切面涂抹處理者用于酶活性測(cè)定，以無菌水處理者作對(duì)照。每個(gè)處理用果實(shí)5個(gè)。

1.2.2 殼聚糖處理對(duì)果皮中抗菌物質(zhì)的影響

1.2.2.1 抗菌物質(zhì)的提取、分離與生物鑒定

參照李永才等[1]的方法，取處理后3 d的果皮組織200 g于研缽中，加入少量甲醇研碎后，加入甲醇浸泡24 h，抽濾后，在真空條件下（220 mmHg）下濃縮，然后用50 mL二氯甲烷萃取3次，萃取液經(jīng)濃縮得提取物。取2 mL粗提物，在TLC（GF25460型薄層層析硅膠）板端1.5 cm處點(diǎn)樣后層析，展開劑為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇=60∶40∶5。將純化的 A.alternata 配成濃度為 1×106個(gè)孢子/mL的懸浮液，然后將孢子懸浮液和Czapek培養(yǎng)基按1∶1的比例充分混勻，同時(shí)加入20 μg/mL鏈霉素以防細(xì)菌污染，用小型噴霧器均勻噴于展開后的TLC板上，然后將板置于無菌、密閉且達(dá)飽和濕度的干燥器中，在25℃下培養(yǎng)6 d～7 d，觀察計(jì)算比移值（Rf），并拍照記錄結(jié)果。

1.2.2.2 果皮抗菌物質(zhì)的成分分析

將上述抑菌帶剝下，用甲醇提取5 min，然后用濾紙過濾濃縮，多次重復(fù)收集足夠濃縮液，進(jìn)行色質(zhì)聯(lián)用儀（HP GC6890－MS5973）分析。

測(cè)試條件：毛細(xì)管柱（30 m×0.25 m×0.25 μm），載氣He的流速為1.2 m/min，進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：60℃～260℃，以5℃/min升溫。質(zhì)譜上的參數(shù)：分離器溫度280℃，離子源能量70 ev，數(shù)據(jù)采集范圍33～550，數(shù)據(jù)采集間隔 2.85 次/s，譜庫：NIST98。

1.2.3 殼聚糖處理對(duì)幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的影響

1.2.3.1 粗酶液的提取

取5 g果肉組織，在4℃10 mL 50 mmol/L的磷酸pH5.0緩沖液中研成勻漿，勻漿在4℃下離心15 min，15 000 r/min，上清液為酶的粗提液。

1.2.3.2 幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定[10]

將0.5 mL酶液與0.5 mL膠狀幾丁質(zhì)及0.1 mL磷酸緩沖液（pH6.4）于40℃水浴中保溫1 h，冷卻離心（4 000 r/min）5 min，取上清液0.5 mL加四硼酸鉀0.1 mL，沸水中準(zhǔn)確加熱3 min，流水冷卻后加入3 mL對(duì)－二甲氨基苯甲醛，混勻后立即放入36℃～38℃的水浴中，20 min后流水冷卻，立即在585 nm下讀數(shù)，在上述條件下測(cè)得的消光值作為酶的活性單位。

1.2.3.3 β－1，3－葡聚糖酶活性的測(cè)定[10]

酶提取液1 mL，0.1 mol/L檸檬酸－0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液（pH4.8）2.5 mL，1%昆布糖 0.5 mL，30℃保溫1 h，蒽酮法測(cè)糖生成量。以分光光度計(jì)上620 nm下的消光值為酶的活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖處理對(duì)果皮抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)

經(jīng)殼聚糖處理的蘋果梨果皮提取物經(jīng)TLC生物活性分析，與未經(jīng)處理的對(duì)照相比有不同比移值的抑菌帶出現(xiàn)，對(duì)照比移值為0.692，殼聚糖處理的比移值為0.239（圖1）。將不同比移值的抑菌帶的甲醇洗脫液經(jīng)濃縮后做GC/MS分析，結(jié)果見表1。

未經(jīng)殼聚糖處理者果皮中主要的抗菌物質(zhì)共有4類13種，分別為酯類、苯噻唑類、有機(jī)酸類和酚類，其中酯類含量最高，占總絕對(duì)含量的44.986%，苯噻唑類含量最低，占總絕對(duì)含量的2.751%。

圖1 對(duì)照和殼聚糖浸泡處理果皮提取物TLC生物活性分析結(jié)果（Rf分別為0.692和0.239）Fig.1 The result of TLC bioactivity analysis of the extract from the peel of the control and chitosan treatment（Rf：0.692，0.239）

經(jīng)殼聚糖處理的蘋果梨果皮中的主要抗菌物共有6類17種，分別為酯類、烷類、酚類、苯噻唑、有機(jī)酸類和烯類，與對(duì)照相比，殼聚糖誘導(dǎo)出烷和烯及多種酯、酚、酸等抗菌物質(zhì)。所有抗菌物質(zhì)中酯類仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)為67.396%，其次為有機(jī)酸類占18.961%，酚類物質(zhì)占7.649%。酯類物質(zhì)中以不同飽和程度的脂肪酸甲酯類含量較高，它們占所有酯類的70.291%。

2.2 殼聚糖處理對(duì)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影響

殼聚糖處理者的幾丁質(zhì)酶活性分別高于對(duì)照48.18%和47.45%，據(jù)蒽酮法測(cè)糖含量，以620 nm下的消光值代表糖含量，同時(shí)代表酶的活性，結(jié)果為2%殼聚糖處理的完整果實(shí)為0.51D，0.75%殼聚糖處理的切開果實(shí)為0.52D，對(duì)照為0.42D，可見用2%殼聚糖處理的果實(shí)與用0.75%殼聚糖處理的果實(shí)β-1，3-葡聚糖酶活性無顯著差異，而二者與對(duì)照相比，酶性分別提高了16.87%和16.65%。如圖2。

表1 對(duì)照和殼聚糖處理后果實(shí)果皮中主要抗菌物質(zhì)成分分析Table 1 Analysis of major ingredient of antifungal compounds from the peel of the control and chitosan treatment fruit

3 結(jié)論與討論

3.1 殼聚糖處理可誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)的生成

圖2 殼聚糖處理對(duì)蘋果梨幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶活性的影響Fig.2 Effect of chitosan-treatment on the activity of chitinase and β-1，3-glucanase

酯類、烷類、酚類、苯噻唑、有機(jī)酸類和烯類是殼聚糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的重要抗菌物質(zhì)。李永才在對(duì)蘋果梨果皮的抗菌物質(zhì)成分分析時(shí)推測(cè)，不同種類的鄰苯二甲酸酯類是采收后具有抗性的物質(zhì)中的一類重要成分[1]，本試驗(yàn)證實(shí)了此推測(cè)，與陳尚武等[11]在分離甜瓜抗菌物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)是典型的抗菌物質(zhì)結(jié)論一致。酚類（單寧、綠原酸等）化合物對(duì)真菌有毒，又是木質(zhì)素形成的前體，所以植物體內(nèi)酚類增多，不但自身可以抗病，而且還可促使病原侵染處木質(zhì)化，因而使植物抗病能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，對(duì)采后60 d的蘋果梨果皮組織粗提液進(jìn)行TLC生物活性分析，其抑菌成分中酚類是抗菌物質(zhì)中較重要的物質(zhì)。烯類物質(zhì)也是本實(shí)驗(yàn)抑菌成分的重要物質(zhì)。烯類作為果實(shí)的抑菌物質(zhì)已有許多報(bào)道，如芒果未成熟時(shí)含有的間苯二酚-5-十七碳-12-烯可抑制盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢的芽管伸長(zhǎng)，鱷梨未成熟果實(shí)對(duì)盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢的抗性與抑菌物質(zhì)1-乙酸基-2-羥基-4-氧代-二十一碳-12，15-二烯及1-乙酸基-2，4-二羥基-n-十七碳-16-單烯有關(guān)。據(jù)報(bào)道[12]，烯類物質(zhì)是脂肪氧化酶的氧化基質(zhì)[2]，所以抑制脂肪氧化酶活性與推遲烯類物質(zhì)降低和減少病害發(fā)生是一致的。

3.2 殼聚糖處理可誘導(dǎo)抗性蛋白的產(chǎn)生

本試驗(yàn)中殼聚糖處理能夠明顯提高蘋果梨果肉組織中幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性，這與El Ghaouth[4]在草莓及張東林等[13]在草莓和樹莓上的結(jié)果相一致。據(jù)報(bào)道，殼聚糖能夠誘導(dǎo)多種果蔬采后這兩種酶的活性，另外可提高PAL和POD活性，從而激發(fā)苯丙烷類代謝，產(chǎn)生酚類和異黃酮類植保素等，并能刺激形成許多結(jié)構(gòu)防御障礙[14]。Mauch F et al[15]證明在離體培養(yǎng)條件下，幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶能夠有效抑制幾種真菌的生長(zhǎng)，但是這些酶在病害防衛(wèi)中的作用尚未證實(shí)。在本試驗(yàn)中，2%殼聚糖對(duì)完整果實(shí)的涂膜與0.75%殼聚糖對(duì)切開果實(shí)涂膜相比酶活性無差異，這表明酶活性的引發(fā)需要與組織的直接接觸，蘋果梨的果皮結(jié)構(gòu)可能物理性地導(dǎo)致殼聚糖與果肉組織的分隔，從而阻止了殼聚糖對(duì)酶活性的誘導(dǎo)。

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