天然產物抗氧化活性的常見評價方法

曾維才，石 碧

（四川大學皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065；四川大學生物質與皮革工程系，四川 成都 610065）

化學學科中，天然產物特指從動物、植物、海洋生物及微生物體內分離的二次代謝產物和內源性化合物[1-2]，主要有生物堿、植物多酚、多肽、糖苷、揮發(fā)油、激素、萜類、甾類、維生素等幾大類[3]。因富含對人體健康有益的活性成分，天然產物在醫(yī)藥、食品、化妝品、保健品等領域得到了廣泛應 用[4]。專門研究天然產物活性成分的功能及結構的科學稱為天然產物化學[5]，它在有機化學、分析化學、生物化學的基礎上迅速發(fā)展。探討天然產物的生物活性及構效關系[6]與生物、醫(yī)藥、食品等學科密切聯(lián)系，已成為化學學科中重要且富有活力的研究領域[7]。統(tǒng)計顯示，2002—2012年SCI（Science Citation Index）收錄的科學論文中約8 萬篇的研究主題是天然產物，占同期化學領域論文總數的6%。

天然產物因成分復雜而具有多種多樣的生物活性，其中，基于抗氧化活性的研究是天然產物領域研究的熱點。對2002—2012年天然產物領域的SCI論文進行統(tǒng)計，約10%是關于天然產物抗氧化活性的研究。20 世紀50年代，Harman 提出“自由基氧化衰老”學說，認為生物體內的多種代謝途徑都會產生具有高度氧化活性的自由基。體內自由基代謝平衡時，產生的自由基會被機體清除，當代謝處于不平衡狀態(tài)時，過量的自由基便會攻擊蛋白質、脂類、核酸等生物大分子，破壞細胞及組織器官，引起氧化損傷（圖1），導致和加速機體衰老，并誘發(fā)各種慢性疾 病[8]。研究還發(fā)現(xiàn)，自由基可引發(fā)食品的鏈式氧化，加速食品的腐敗變質，帶來嚴重的食品安全隱患，影響人體健康[9]。為了有效地預防和控制自由基氧化損傷給人體帶來的危害，丁基羥基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基對甲苯酚（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）等化學合成抗氧化劑被廣泛應用[10]。但隨著公眾對其潛在負面效應及安全性的認識，這類化學合成抗氧化劑的使用逐漸被限制或禁止，研究者開始轉向從天然產物中制取高效無毒的抗氧化劑[11]。

在尋找天然抗氧化劑的研究中，通過抗氧化活性評價，篩選出有益人體健康的化合物，是經典的研究思路[12]。整個研究中，對天然產物抗氧化活性的評價是核心和基礎，對后續(xù)研究有重要的指導意義。不同評價方法的實驗原理、適用范圍各不相同，所得結果也有差異。要準確全面地考察天然產物的抗氧化活性，需同時采用多種評價方法。本文對天然產物抗氧化活性常見評價方法的原理、體系及優(yōu) 缺點進行歸納總結，以期為相關領域的研究人員進行快速、準確的實驗測試提供參考。

圖1 自由基在體內的代謝及對生物體的危害

1 體外抗氧化評價方法

1.1 化學分析法

化學分析法主要通過化學方法測定天然產物對自由基的清除能力或對脂類物質氧化的抑制能力，從而評價天然產物的抗氧化活性。

1.1.1 ABTS 自由基陽離子清除實驗

ABTS[2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonate，2,2'-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]自由基陽離子清除實驗是根據不同濃度受試物對ABTS 自由基陽離子溶液吸光度的影響測定天然產物對ABTS 自由基陽離子的清除能力，該方法最早由Miller 提出[13]，經Re 等[14]改進后被廣泛用于天然產物抗氧化活性的測試。在Trolox（維生素E 的水溶性類似物）被當作標準物用于實驗測試時，此方法又稱為 TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）法[13]。實驗中，ABTS 在氧化劑的過氧化作用下形成一種亞穩(wěn)態(tài)的自由基陽離子，見圖2，該物質易溶于水和酸性乙醇溶液，于415 nm、660 nm、734 nm、820 nm 波長處均有吸收。在抗氧化物質的作用下，ABTS 自由基陽離子被部分清除，溶液吸光度降低，通過與空白組實驗結果的比較，得到受試物對ABTS 自由基陽離子的清除效果。

圖2 ABTS 自由基陽離子的化學結構

常用實驗方法如下：用純水配制含ABTS（7 mmol/L）與過硫酸鉀（2.45 mmol/L）的混合溶液，置于23 ℃的暗處孵育12～16 h，制備ABTS 自由基陽離子基液。用純水稀釋基液至其在波長734 nm處吸光度為0.700±0.005，得ABTS 自由基陽離子工作液。取0.1 mL 不同濃度受試物溶液同3.9 mL工作液混合，23 ℃ 孵育6 min，測量反應混合物在734 nm 處的吸光度，純水做空白對照[15]。計算方法如式（1）。

ABTS 自由基陽離子在水及醇溶劑中均有較好的溶解性，可用于水溶性及脂溶性天然產物抗氧化活性的測定。該方法簡單快捷，無需復雜的反應步驟及苛刻的反應條件，可測定酸性、中性及弱堿性化合物的自由基清除能力。同時，該方法也避免了受試物中含有的過氧化物對ABTS 自由基的影響，能準確測定多成分混合物的抗氧化能力，故較多用于天然產物抗氧化活性的評價[16-18]。該方法的缺點是反應時間對該方法的測定結果有影響，不同的反應時間所得測試結果差異明顯。其次，該方法不能真實反映活性物質在生物體內的抗氧化能力，也不能表征不同物質間抗氧化反應速度的差異。

1.1.2 DPPH 自由基清除實驗

DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種在氮氮連接鍵上含有不對稱價電子的氮族自由基（圖3），它能穩(wěn)定存在，于517 nm 處有最大吸收值，易與具有氫鍵供體的化合物發(fā)生電子轉移反應[19]。DPPH 自由基清除實驗中，受試物給出的氫原子與DPPH 自由基結合，使反應溶液的吸光度發(fā)生變化，通過比較實驗組與空白組溶液吸光度的變化評價受試物的抗氧化活 性[20]。此方法最早由Blois 提出[21]，后經大量實驗改進，已成為評價天然產物抗氧化活性的一種常用方法[22]。

圖3 DPPH 自由基的化學結構

常用實驗方法如下：以95%的乙醇為溶劑配制濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 自由基溶液，此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取2.0 mL 不同濃度的受試物溶液同 2.0 mL DPPH 溶液混合，25 ℃避光孵育30 min，于517 nm 處測定反應溶液的吸光度，95%乙醇做空白對照[23]。計算方法如式（2）。

采用DPPH 自由基清除實驗測定物質的抗氧化活性是一種簡單有效、經濟可靠的方法，其結果重復性好，受環(huán)境因素影響較小[24]。同其它測試方法相比，該方法所用自由基穩(wěn)定，靈敏度高，無需其它復雜反應，可與色譜分離法結合，用于天然產物抗氧化活性的在線檢測[25]。但是DPPH 自由基僅溶于有機溶劑，對路易斯堿或溶劑敏感，在光照的富氧環(huán)境中易分解，易與烷基類自由基發(fā)生反應，在乳液體系及蛋白質體系的使用也受到限制[26-28]。此外，因受試物本身所具有的顏色對測定結果有較大影響，該方法也不適用于顏色較深樣品的抗氧化能力測定[29]。

1.1.3 超氧陰離子自由基清除實驗

超氧陰離子（O2·-）是需氧細胞線粒體內電子轉移產生的一種自由基[30]。它由氧分子接收一個電子形成，同生物體內其它活性氧自由基的產生有密切聯(lián)系（圖4）[31]。超氧陰離子在生物體內可長時間攻擊靶向目標，對細胞有較強的氧化毒性，與人體的衰老及癌癥等疾病的發(fā)生有關[32]。許多實驗體系均可用于模擬細胞內超氧陰離子自由基的產生及清除，其中鄰苯三酚法使用最為普遍。鄰苯三酚在堿性環(huán)境中發(fā)生自氧化鏈式反應并釋放出大量的超氧陰離子，超氧陰離子又進一步加速鄰苯三酚的氧化，生成一系列在可見光區(qū)有特征吸收的中間產物。在反應體系中加入抗氧化物質可降低鄰苯三酚的自氧化速率，清除產生的超氧陰離子，抑制中間產物的生成，使反應溶液的吸光度減小。通過比較實驗組與空白組鄰苯三酚的自氧化速率評價受試物的抗氧化能力[33]。

圖4 超氧陰離子的產生

常用實驗方法如下[34]。

鄰苯三酚自氧化速率的測定。Tris-HCl 緩沖液 （50 mmol/L，pH 值 8.2，4.5 mL）與純水（4.2 mL）混合，25 ℃ 孵育20 min，快速加入0.3 mL 鄰苯三酚溶液（3 mmol/L，用10 mmol/L 鹽酸配制，經25 ℃預熱），混勻后記錄5 min 內反應溶液在320 nm處的吸光度變化，繪制時間（t）-吸光度（A）曲線，在線性范圍內計算反應物單位時間內吸光度的改變，得出鄰苯三酚的自氧化速率。

受試物作用下鄰苯三酚自氧化速率的測定：Tris-HCl 緩沖液（50 mmol/L，pH 值 8.2，4.5 mL）與純水（3.3 mL）混合，25 ℃孵育20 min，快速加入0.9 mL 受試物及0.3 mL 鄰苯三酚溶液（3 mmol/L，用10 mmol/L 鹽酸配制，經25 ℃預熱），混勻后記錄5 min 內反應溶液在320 nm 處的吸光度變化，繪制時間（t）-吸光度（A）曲線，在線性范圍內計算反應物單位時間內吸光度的改變，得出受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率，如式（3）。

式中，V0為鄰苯三酚的自氧化速率；V1為受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率。

利用鄰苯三酚自氧化體系測定受試物對超氧陰離子自由基的清除作用是一種簡單快捷地評價天然產物抗氧化活性的方法[35]。該方法測定時間短、靈敏度高（受試物的實驗濃度一般是微克），能較好地模擬超氧陰離子在細胞內的產生及清除過程[36]。然而，實驗體系生成的超氧陰離子不穩(wěn)定，會進一步氧化，易受雜質影響，實驗中需嚴格控制測定時間并在線性區(qū)限內取值計算。

1.1.4 羥自由基清除實驗

羥自由基（OH·）是生物細胞內反應活性最強的氧族自由基，可由超氧陰離子和過氧化氫在金屬離子的作用下產生，如圖5 所示[37]。它具有很高的電子還原電勢（2310 mV），能與生物體內所有的物質發(fā)生反應，如脂類、多肽、蛋白質、核酸等，對生物大分子產生最強的氧化破壞效應，引起細胞與組織的氧化損傷，導致器官的病變與機體的衰 老[38-40]。對羥自由基清除能力的測定是評價天然產物抗氧化活性的重要組成部分。通常采用水楊酸競爭捕捉羥自由基的方式進行測定。實驗體系中，過氧化氫在亞鐵離子作用下生成羥自由基，向體系中加入水楊酸捕捉羥自由基，同時產生在可見光區(qū)有特征吸收的紫色產物。在反應體系中加入抗氧化物質，與水楊酸競爭捕捉羥自由基，使生成的紫色產 物減少，溶液的吸光度發(fā)生改變。通過比較實驗組與空白組反應溶液吸光度的變化評價受試物的抗氧 化活性[41]。

圖5 羥自由基的產生

常見實驗方法如下：1 mL 受試物溶液與1 mL硫酸亞鐵溶液（FeSO4·7H2O，9 mmol/L）、1 mL 過氧化氫溶液（10 mmol/L）混勻，37 ℃ 孵育10 min，加入1 mL水楊酸溶液（9 mmol/L），混勻后37 ℃ 孵育30 min，于510 nm 處測定反應溶液的吸光度，純水做空白對照[42]。計算方法如式（4）。

上述方法根據Fenton 反應的原理，采用硫酸亞鐵和過氧化氫作為羥自由基的產生源，通過與水楊酸競爭性捕捉羥自由基評價天然產物的抗氧化活性。該實驗方法步驟簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能清楚地模擬生物細胞內羥自由基的清除過程，常用于醫(yī)學及分子生物學領域抗氧化物質的篩選[43]。 但實驗體系對受試物的濃度及pH 值有較高要求，一般適用于酸性或中性物質[44]。

1.1.5 脂質過氧化抑制實驗

脂質過氧化主要是指多不飽和脂肪酸在富氧環(huán)境中發(fā)生的一種氧化變質，是一類自由基鏈式反應（圖6），既產生自由基，又需要自由基進一步推動反應[45]。脂質過氧化會在生物體內產生大量的有毒物質，如活性氧、氫過氧化物及丙二醛等，引起細胞膜功能障礙、生物酶活性降低、細胞成分降解，導致細胞的氧化損傷，與人體的動脈粥樣硬化、高血糖、高血脂、高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[46-49]。在體外，通常采用硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）法檢測抗氧化物質對脂質過氧化的抑制效果。該實驗方法利用脂質源在亞鐵離子的作用下氧化分解產生丙二醛及其類似物，在高溫和酸性條件下，與硫代巴比妥酸反應生成粉紅色產物，該物質在可見光區(qū)有特征吸收。向反應體系中加入抗氧化物質，抑制脂質過氧化的發(fā)生，粉紅色產物生成量減小，反應溶液吸光度發(fā)生改變。通過比較空白組與實驗組的吸光度變化評價受試物的抗氧化活性[50]。

圖6 脂質過氧化中的自由基鏈式反應

常見實驗方法如下：使用雞蛋黃勻漿液（10%，體積分數）作為反應的脂質媒介。取0.1 mL 受試物溶液同0.5 mL 蛋黃勻漿液、0.4 mL 純水及50 μL硫酸亞鐵溶液（FeSO4·7H2O，70 mmol/L）混合，37 ℃孵育 30 min，迅速加入1.5 mL 乙酸溶液（20%，體積分數，pH 值 3.5）及 1.5 mL 硫代巴比妥酸溶液（0.8%，質量濃度，用 1.1% 十二烷基硫酸鈉溶液配制），高速混勻后95 ℃ 水浴 60 min。待反應混合物冷卻至室溫，加入5 mL 正丁醇，搖勻，混合物5000 r/min 離心15 min，取上清液測定其在532 nm 處的吸光度，純水做空白對照[51]。計算方法如式（5）。

測定天然產物對脂質過氧化的抑制作用是評價其抗氧化活性的重要組成部分。采用雞蛋黃作為反應的脂質來源，亞鐵離子為氧化劑，適用于各種脂蛋白的過氧化損傷模型，可直接反映出天然產物對脂類的保護作用。該方法步驟較多，操作繁瑣，實驗體系中除包含磷脂外，還含有脂蛋白、脂肪酸等成分。此外，亞鐵離子的濃度對測定結果有一定 影響，在比較不同實驗結果時應注意實驗體系的 差別[52]。

1.1.6 還原能力的測定

還原能力是表征物質在氧化還原反應中給出電子自身發(fā)生氧化的能力，既是物質抗氧化活性的重要表現(xiàn)，又是對其抗氧化能力的合理解釋[53]。實驗研究中通常采用三價鐵離子還原法觀察物質的還原能力[54-55]，其化學原理是鐵氰化鉀中的三價鐵離子在受試物的作用下被還原成亞鐵離子，生成亞鐵氰化鉀。殘留的三價鐵離子與亞鐵氰化鉀反應生成普魯士藍（圖7）。該物質在700 nm 處有特征吸收，其生成量與受試物的還原能力成一定比例，吸光度值越大，說明受試物的還原能力越強[56]。

常見實驗方法如下：取2.5 mL 不同濃度的受試物溶液，與2.5 mL 磷酸緩沖液（0.2 mmol/L，pH值6.6）和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（l%，質量分數）混勻，50 ℃孵育20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%，質量分數），混合后3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 純水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（0.1%，質量分數），混勻，測定混合物溶液在700 nm 處的吸光度。吸光度值 越大，表示受試物的還原能力越強[56]。

圖7 普魯士藍的生成

鐵離子還原法測定物質的還原能力常用于天然 產物抗氧化活性的評價。該方法簡單靈敏、快速方便，結果具有較高的可重復性，試劑及儀器設備要求低，既適用于純物質，也適用于天然產物等混合物還原能力的體外測定[57]。實驗體系中會大量生成亞鐵離子，易與過氧化氫生成羥自由基，限制了此方法在體內還原能力測定中的使用[58]。實驗體系對pH 值要求較高，需在酸性環(huán)境中進行，實驗結果不能全面體現(xiàn)物質的抗氧化能力[59-60]。

1.1.7 脂質氧化測定實驗

測定受試物對脂質氧化降解的抑制是測定其在實際物品或體系中抗氧化活性最為方便快捷的方法。其實驗原理為：脂質中的不飽和脂肪酸自動氧化，生成不穩(wěn)定的氫過氧化物，氫過氧化物繼續(xù)分解形成醛、酮、酸等小分子化合物，使脂質的過氧化值、碘值、游離脂肪酸含量等指標發(fā)生改變。通過碘量滴定法（圖8）測定實驗組及空白組脂質過氧化值的改變，評價受試物的抗氧化活性[61]。

常見實驗測定方法如下。在脂質中添加不同量的受試物，置70 ℃恒溫烘箱孵育，間隔24 h 測定油脂的過氧化值（POV）。POV 的測定方法為：取2 mL 油樣加入20 mL 冰乙酸與氯仿的混合液（1∶1，體積分數）及1 mL 飽和碘化鉀溶液，暗處放置3 min后加入30 mL 純水，以淀粉溶液（1%，質量分數）作指示劑，用0.01 mol/L 的硫代硫酸鈉標準溶液滴定，同時做空白試驗，POV 值按式（6）計算[62]。

圖8 碘量滴定法原理

式中，V1為試樣耗用硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；V2為空白耗用硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL； CS為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；m為受試物的質量，g；0.269 為硫代硫酸鈉標準溶液1 mL 相當于碘的克數。

采用碘量滴定法測定物質對脂質氧化程度的抑制能有效地反應受試物在實物體系中對氧化過程的抑制。該方法體系穩(wěn)定，結果可靠，但靈敏度低，選擇性較差，對受試物的溶解性、反應條件、實驗溶劑等都有較高要求，不適于非脂溶性天然產物抗氧化能力的測定[63]。

除上述常見測定方法外，化學分析法中還有ORAC（oxygen radical absorbance capacity，氧自由基吸收能力）測定法[64]、CUPRAC（cupric reducing antioxidant power，二價銅離子還原能力）測定法[65]、TRAP（total radical antioxidant parameter，總抗氧化能力）測定法[66]、TOSC（total oxyradical scavenging capacity，氧族自由基總清除能力）測定法[66]及PCL（photochemiluminescence，光化學發(fā)光）法[67]等多種評價天然產物抗氧化活性的實驗方法。這些測試方法按抗氧化作用機理可劃分為氫原子轉移（HAT，hydrogen atom transfer）機制和單電子轉移（SET，single electron transfer）機制（圖9）?；贖AT 機制的方法（如脂質過氧化抑制實驗和ORAC 法），其實驗條件接近生理環(huán)境，能真實地模擬生物體內活性氧自由基的產生及清除過程，但操作復雜，條件苛刻；基于SET 機制的方法（如三價鐵離子的還原和CUPRAC 法）則是通過測定氧化還原能力間接測定物質的抗氧化能力，其生理相關性較差，但方便簡單，測定快捷[68]。通常情況下，不同方法的測定結果有差異，應相互補充，才能全面地反映天然產物的抗氧化活性[69]。

圖9 氫原子轉移（HAT）和單電子轉移（SET）機制

上述化學分析方法在天然產物抗氧化活性評價中有非常重要的作用，但也有明顯的不足。天然產物是一種成分復雜的混合物，而化學分析法通常只適用于較純化學物質抗氧化活性的測定，測定結果 僅反映某單一成分的抗氧化值，難以真實地反映天然產物整體的抗氧化活性；檢測體系通常只針對具有某一類理化特性的天然產物（如水溶性或脂溶性）做出抗氧化活性的測定，生物相關性較差。此外，天然產物的抗氧化活性不僅能清除自由基，它還可以通過提高內源性抗氧化物質的水平起到抗氧化的效果[70-72]。因此，化學分析法的測定結果不能全面反映天然產物的抗氧化活性及其在生物細胞內的吸收、代謝和利用等情況。為了能更好地反映天然產物在細胞生理條件或生物體內起到的抗氧化作用，以細胞為模型的抗氧化活性測試方法在天然產物抗氧化活性評價研究中逐步得到采用[73-75]。

1.2 細胞抗氧化活性評價方法

以細胞為基礎的活性篩選模型是藥物化學中研究藥物分配、吸收及與載體或酶等生物大分子相互作用的有效方法，能夠經濟、快速且準確地闡明化學物質在生物體內的吸收、運輸及代謝等現(xiàn)象的機理[76]。通過細胞模型實驗評價天然產物的抗氧化活性（即細胞抗氧化活性評價方法，cellular antioxidant activity，CAA），比化學分析法更具生物相關性，又比動物模型和臨床研究更快捷、經濟，是天然產物抗氧化活性研究中的一種重要手段[77]。

1.2.1 實驗原理

細胞經抗氧化活性物質（AOX）及指示劑2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）共同處理，AOX與細胞膜結合并進入細胞，DCFH-DA 也進入細胞，細胞酯酶分解DCFH-DA 形成高極性的還原型二氯熒光素（DCFH）。再用2,2,-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（ABAP）處理細胞，ABAP 分散于細胞中并形成過氧化自由基ROO·。過氧化自由基攻擊細胞膜產生更多自由基或活性氧（reactive oxygen species，ROS）。細胞內的DCFH 極易被氧化形成氧化型二氯熒光素（DCF），該物質具有強熒光性，可通過分光光度法測定?？寡趸钚晕镔|可在細胞外結合氧自由基阻斷其進入細胞，或在細胞內與ROS 和ROO·結合阻斷DCFH 氧化形成DCF，降低細胞的熒光性。通過比較實驗組與空白組細胞熒光物質的生成量評價受試物的抗氧化活性（圖10）[78]。

1.2.2 常見實驗方法

實驗細胞按6×104個/孔的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h，除去培養(yǎng)基，用含5%牛胎血清的VE 培養(yǎng)基（PBS）洗滌。每孔用100 μL 含不同濃度受試物與25 μmol/L DCFH-DA 的混合溶液處理1 h（37 ℃、5% CO2）。用PBS 洗滌，除去DCFH-DA。然后用100 μL ABAP（600 μmol/L）處理，用熒光酶標儀于538 nm 處測定細胞培養(yǎng)物的熒光值，間隔5 min 測定一次，持續(xù)1 h。對照組用DCFH-DA 和ABAP 處理，空白組只用DCFH-DA 處理。繪制熒光值隨時間的變化曲線，計算受試物的CAA 值，CAA 值越高，抗氧化活性越好[79]。

圖10 CAA 法的實驗原理

式中，∫SA 為受試物熒光值相對于時間曲線下的完整面積；∫CA 為空白組熒光值相對于時間曲線下的完整面積。

以細胞為基礎的抗氧化實驗更能說明抗氧化天然產物的作用機理，并能真實地模擬生物體的內部環(huán)境，測試結果更具理論說服力和應用價值，已被廣泛用于果蔬汁、咖啡、茶葉等食源性天然產物的抗氧化活性研究。使用該方法測定天然產物的抗氧化活性時應注意受試物本身性質對實驗的影響。多數天然產物在高濃度條件下能顯著增加DCF 熒光的猝滅，直接影響細胞培養(yǎng)物熒光值的測定；脂溶性天然產物需用二巰甲基輔助溶解后才能進行實驗，不必要干擾物質的引入也對實驗結果有影 響[80]。因此，實驗測試前需對受試天然產物的性質進行了解，適當地對實驗手段進行改進。在細胞抗氧化實驗中，除上述常見的CAA 測定法外，還有MTT{3-[4,5-dimethylthiahiazo(-z-y1)]-3,5-di- phenytetrazoliumromide，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍}法[81]、乳酸脫氫酶釋放法[82]、ATP（adenosine triphosphate）測定法[83]等方法，可檢測受試物對氧化受損細胞生命力的恢復及對細胞內外自由基的清除能力。

2 體內抗氧化評價方法

抗氧化活性的體外測試是評價天然產物抗氧化活性的一個重要手段，但其測定結果并不能完全代表抗氧化物質在生物體內的代謝和利用情況。天然產物往往是成分復雜的混合物，須經消化道各種酶和降解條件消化后才能被生物體吸收，達到靶向細胞發(fā)揮作用。而生物體的消化吸收是一個極其復雜的生理過程，體外簡單的化學分析或細胞實驗的測試結果與天然產物進入生物體產生作用的實際情況有很大差別[84]。因此，需在參考體外抗氧化實驗的基礎上進行體內抗氧化實驗，真實評價天然產物在生物體內的抗氧化活性。實驗以動物為模型，對其飼喂受試物，利用生化手段對其各項相關的生理指標進行測定，通過實驗組與空白組各項指標的比較評價受試物在生物體內的抗氧化活性。

常見實驗方法如下[85]：選用清潔級大鼠或小鼠為對象，用受試物按實驗研究計量及時間連續(xù)飼喂，完成后處死動物，根據實驗目的取其血液或組織器官，測定其中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）及過氧化氫酶（CAT）等指標，同空白對照組比較，從而得出受試物在生物體內的抗氧化能力。

體內抗氧化實驗建立在生理學、毒理學及病理學基礎上，采用生化技術對實驗動物進行測試，測定結果真實反映了天然產物在生物體內的抗氧化作用。此外，在檢測受試物抗氧化活性的同時，也對其生理毒性及藥理作用進行了評價[86]。除采用健康動物測試外，體內實驗還多采用人為制造的疾病動物為模型，研究天然產物對某一靶向疾病或組織的作用[87]?？寡趸钚缘捏w內評價適用于經體外篩選后的活性化合物，其檢測指標多且復雜，實驗周期長，費用昂貴，不適用于抗氧化天然產物的前期篩分及大批量檢測。

3 總結與展望

評價天然產物抗氧化活性的基本要求是全面準確地體現(xiàn)其抗氧化效果，既要測定其體外抗氧化能力，又要考慮其在生物體內的抗氧化效果。理想的抗氧化活性評價方法應具有以下特點：①原理明確；②操作簡單；③可反映物質對絕大多數自由基的抑制或清除能力；④生物相關性良好[88]。在大量實驗的基礎上，研究者們建立了許多天然產物抗氧化活性的評價方法，這些方法因反應原理、自由基種類等的不同而不同，各有優(yōu)勢和局限性。單獨使用某一種方法，其測試結果都或多或少有所不足，無法全面、準確地評價天然產物的抗氧化活性。因此，實驗研究需根據受試天然產物本身的性質及用途，采用多種測試方法建立一套合理的評價體系，從而高效、準確地表征天然產物的抗氧化活性。隨著電分析化學、納米科學與分子生物學等領域的發(fā)展，電子捕捉與自旋共振成像、納米材料誘導氧化損傷、DNA 合成阻斷等新技術被應用到天然產物抗氧化活性的評價中，從微觀層面進一步分析和探究天然產物對生物體氧化損傷的保護作用[89]。在天然產物抗氧化活性的研究中，還應采用從體外實驗到體內測試，由化學分析到生物評價逐級深入的原則[90]。根據體外實驗的結果進行動物實驗，在動物實驗的基礎上再進一步開展臨床人體測試，為天然產物在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域的應用提供理論基礎。

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