李敏杰，陸兆新，趙海珍

( 南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095)

葛縷子(Carum carvi L)，別名藏茴香，為傘形科植物貢蒿的果實，其植物為多年生草本，分布西亞、歐洲，我國東北、華北、西北、四川、西藏等地。歐洲自古以來就把它作為芳香性驅(qū)風藥和香料使用，《英國藥典》1993 年版收載用于治療腹脹和消化不良［1］，在我國葛縷子除作為調(diào)味料外，也是常用的藏藥之一，葛縷子性溫、味微辛，具有理氣、止痛、解毒作用［2］?！吨腥A本草》中藏茴香的功能主治為理氣、止痛、解毒，主治“龍”病、眼病、食欲不振、胃痛、中毒癥［3］。藏茴香含揮發(fā)油，油中含葛縷酮(carvone)、檸檬烯(limonene)及β-蒎烯等萜烯化合物，其中葛縷酮含量最高，為主要成分，其次是檸檬烯［4-6］。近年來，研究表明葛縷子精油還具有抗細菌、抗真菌、抗氧化、胃腸道保護、抗癌、抗黃曲霉毒素產(chǎn)生等作用［5，7-12］，因此葛縷子精油被廣泛用作食品添加劑、調(diào)味劑和化妝品香精等。葛縷子精油的提取方法有水蒸氣蒸餾法［13］、溶劑提取法［14］和超臨界流體萃取技術(shù)［6，15］等。水蒸氣蒸餾由于操作溫度較高且時間較長會引起精油中熱敏性化合物的熱分解和易水解成分的水解;有機溶劑提取需要消耗大量的溶劑且提取率低，而超臨界提取需要較高的壓力。近年來，超聲波提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中顯示了巨大的優(yōu)勢。超聲波萃取或超聲波輔助萃取的原理是利用超聲波輻射壓強產(chǎn)生的強烈空化效應和次級效應(如機械振動、如花、擴散、擊碎、化學效應等)，提高萃取成分分子的運動速度和頻率，增強溶劑穿透力，從而使萃取成分與溶劑充分混合，加大了萃取的效率，加快了植物有效成分的溶出［16］。目前此方法倍受廣大研究者的關(guān)注，并且大量應用于開發(fā)植物精油的萃取，如萃取鼠尾草精油、芳香植物精油(月桂、迷迭香、百里香、牛至和晚香玉)、大蒜揮發(fā)油等的研究。此方法最大的優(yōu)點就是萃取溫度較低、時間短、得油率高、節(jié)約能源。王欣等［17］采用超聲波輔助法提取豐年蟲油，結(jié)果表明該方法的提取時間(40min)比傳統(tǒng)的溶劑抽提法時間(6h)縮短了8 倍，且油脂品質(zhì)也比較高。本實驗以NaCl 溶液作為鹽析試劑，采用超聲輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾法對葛縷子精油進行提取，對所提取精油的化學成分進行氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分離鑒定，并與鹽析-水蒸氣蒸餾法的提取效果和精油成分進行比較，為葛縷子的有效開發(fā)和合理利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛縷子樣品(干樣)，產(chǎn)地西藏，將其用粉碎機粉碎過40 目篩，裝入事先準備好的玻璃密封瓶內(nèi)，置于陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

SB-500DTY 超聲波掃頻清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;水蒸氣提油蒸餾裝置，上海禾汽玻璃儀器有限公司;HP6890/5973 氣相色譜-質(zhì)譜儀美國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾提取葛縷子精油 準確稱取10g葛縷子粉末按1∶15 料液比加入一定體積的15%氯化鈉溶液，浸泡60min 后加熱進行回流提取。當流出的餾分中無油珠時，停止蒸餾。分出葛縷子精油利用無水硫酸鈉脫水，稱量，計算精油的得率。所提精油低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 超聲波輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾提取葛縷子精油 準確稱取10g 葛縷子粉，放入圓底燒瓶中，按照一定的料液比與氯化鈉溶液混合并浸泡一定時間，將圓底燒瓶放入超聲波儀中，先在一定的功率、頻率和溫度下處理一定的時間，使植物細胞壁破碎，然后按照1.2.1 方法繼續(xù)加熱進行回流提取，用無水硫酸鈉干燥，稱重，計算精油得率。

1.3 實驗設計

1.3.1 料液比對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，以10%氯化鈉溶液浸泡30min，在超聲波功率300W、頻率40kHz 的條件下處理30min，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，W/V)對葛縷子精油得率的影響，確定合適的料液比。

1.3.2 氯化鈉濃度對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，以1 ∶15 料液比混合，浸泡30min，超聲波功率300W、頻率40kHz 的條件下處理30min，考察氯化鈉濃度(5%、10%、15%、20%、25%)對葛縷子精油得率的影響，確定合適的料液比。

1.3.3 浸泡時間對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，與15%氯化鈉以1∶15 的料液比混合，浸泡一定時間后，在超聲波功率300W、頻率40kHz 的條件下處理30min，考察浸泡時間(15、30、45、60、75min)對葛縷子精油得率的影響，確定合適的浸泡時間。

1.3.4 超聲功率對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，與15%氯化鈉以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在不同超聲功率(200、250、300、350、400W)和頻率40kHz 的條件下處理30min，考察超聲功率對葛縷子精油得率的影響，確定合適的超聲功率。

1.3.5 超聲時間對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，與15%氯化鈉以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在超聲功率250W 和超聲頻率40kHz 的條件下處理 不 同時間(15、30、45、60、75min)，考察超聲時間對葛縷子精油得率的影響，確定合適的超聲時間。

1.3.6 超聲頻率對葛縷子精油得率的影響 準確稱取10g 葛縷子粉末，與15%氯化鈉以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在超聲功率250W 和不同超聲頻率下(25、28、40、59kHz)處理30min，考察超聲頻率對葛縷子精油得率的影響，確定合適的超聲頻率。

1.4 GC-MS 分析

葛縷子精油成分用HP 6890(II)GC-MS 進行分析鑒定，配有HP 5973 質(zhì)譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，California，USA)，電子能量70eV。色譜柱為HP-5MS 毛細管柱(30m × 0.25mm，0.25μm film thickness);程序升溫:起始溫度50℃，以5℃/min 升至60℃，保持5min;以4℃/min 升至220℃，保持15min;載氣(He)流速1.0mL/min;進樣口溫度250℃，進樣量1μL，分流比:50∶1。電子轟擊(EI)離子源;傳輸線溫度250℃;離子源溫度 230℃;四級桿溫度150℃;質(zhì)子掃描范圍m/z 50-550;溶劑延遲時間4min。

精油的組成通過與GC-MS 系統(tǒng)的NIST 質(zhì)譜庫比對進行鑒定;采用面積歸一化法進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對葛縷子精油得率的影響

適當?shù)牧弦罕瓤梢允乖辖莩浞?，達到更好的質(zhì)壁分離效果，從而提高精油得率。由圖1 可知，隨著料液比增大，葛縷子精油得率逐漸提高，當料液比為1∶15 時，超聲波輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾法提取的葛縷子精油得率最高(4.08%)。溶劑量增加，會降低溶劑中葛縷子精油濃度，增加葛縷子精油與溶劑接觸界面處濃度差，從而提高傳質(zhì)速率［18］，在一定時間內(nèi)精油得率提高，但當料液比過高時，精油得率不但不會增加，反而有所降低，原因可能是溶劑量過多時，增溶于溶劑中的總精油量變化不大，但損失于溶劑中的量增加，故最終的精油得率降低。因此，選擇料液比1∶15 作為后續(xù)研究條件。

圖1 料液比對葛縷子精油得率的影響Fig.1 Effect of material to solvent ratio on caraway essential oil extraction

2.2 氯化鈉濃度對葛縷子精油得率的影響

張芳等［19］在提取橘皮精油時發(fā)現(xiàn)采用氯化鈉溶液可以提高精油產(chǎn)量并改善其質(zhì)量，這可能是由于氯化鈉的鹽析作用使得更多精油能夠被水蒸汽攜帶出來。本文也研究了氯化鈉溶液對葛縷子精油得率的影響(圖2)。由圖可知，葛縷子精油得率隨氯化鈉濃度的增大逐漸升高，15%時達到最大，隨后精油得率開始逐漸降低。這可能是由于高濃度氯化鈉溶液會導致溶液爆沸，蒸餾無法控制，使得精油中的易揮發(fā)成分損失增加。這與Rivera 等［4］的結(jié)果相一致。Rivera 等采用磁場直接傳導加熱蒸餾葛縷子精油，發(fā)現(xiàn)提取液中氯化鈉濃度越高精油產(chǎn)率越低，定量檢測發(fā)現(xiàn)，隨氯化鈉濃度升高，精油中檸檬烯含量降低，葛縷酮的含量升高;當氯化鈉濃度為10%和12%時，磁場直接傳導加熱的蒸餾開始爆沸，失去控制。本研究中最佳氯化鈉濃度是15%。

圖2 氯化鈉濃度對葛縷子精油得率的影響Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on caraway essential oil extraction

2.3 浸泡時間對葛縷子精油得率的影響

植物精油存在于植物的腺毛、油室、油管、分泌細胞或樹脂道等各種組織和器官中，采用溶劑浸泡后可以使組織的細胞壁和細胞膜膨脹，進而分裂，植物內(nèi)的精油隨之分解出來，因此浸泡時間在一定程度上可以影響精油得率。由圖3 可知，浸泡時間對葛縷子精油得率有一定的影響，但影響不明顯(p ＞0.05)。浸泡時間為60min 時葛縷子精油得率最高，因此后續(xù)實驗中浸泡時間為60min。

圖3 浸泡時間對葛縷子精油得率的影響Fig.3 Effect of soaking time on caraway essential oil extraction

2.4 超聲功率對葛縷子精油得率的影響

由圖4 可知，葛縷子精油得率隨超聲功率的增大先提高后又降低，功率偏大和偏小時所得精油得率都不高，功率為250W 時精油得率最高。其原因可能是:當超聲波功率較低時，超聲波產(chǎn)生的空化作用較小，隨著超聲波功率的增大，其產(chǎn)生的空化作用也逐漸增強，使得原料細胞更充分的破裂，加速精油有效成分的滲出，使得精油得率提高;但在相同超聲時間下，超聲功率過大時，其空化效應大幅度增強，精油與體系的乳化作用也增強，損失于水介質(zhì)的精油量也增加。因此最適超聲功率為250W。

圖4 超聲功率對葛縷子精油得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on caraway essential oil extraction

2.5 超聲時間對葛縷子精油得率的影響

由圖5 可知，隨著超聲時間的延長，葛縷子精油得率提高，30min 時達到最高，45min 時保持不變，之后隨著超聲時間的延長精油得率下降。其原因主要是:一方面，隨著超聲時間的增加，細胞的破碎程度增加，有利于精油進入溶劑中;但另一方面，由于精油是易揮發(fā)的氧化性物質(zhì)，當時間過長時，超聲的熱效應過大，溫度過高，導致精油得率下降。綜合考慮多方面因素(操作時間、能耗及提取效率等)，最適超聲作用時間為30min。

圖5 超聲時間對葛縷子精油得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on caraway essential oil extraction

2.6 超聲頻率對葛縷子精油得率的影響

由圖6 可知，葛縷子精油得率隨超聲頻率的變化產(chǎn)生明顯的變化，隨超聲頻率的增加精油得率逐漸下降，當頻率增加到59kHz 時，精油得率顯著下降。超聲頻率高時空化效應明顯，有助于產(chǎn)物的滲出，但超聲頻率高時也有助于產(chǎn)物與提取體系乳化作用的發(fā)生，這樣產(chǎn)物損失于提取介質(zhì)中的量也增加，故而可能會導致產(chǎn)物最終產(chǎn)率的降低。因此，本實驗中最適超聲頻率為25kHz。

2.7 超聲輔助鹽析-水蒸氣蒸餾法最優(yōu)結(jié)果及與鹽析-水蒸氣蒸餾法的比較

根據(jù)上面的單因素實驗結(jié)果，獲得超聲輔助鹽析-水蒸氣蒸餾法提取葛縷子精油的最佳條件為料液比1∶15，氯化鈉濃度為15%，浸泡時間60min，超聲頻率25kHz，超聲功率250W，超聲時間30min。在最佳條件下進行提取實驗，葛縷子精油得率為5.42%±0.01%。將鹽析-水蒸氣蒸餾提取法與超聲波輔助鹽析-水蒸氣蒸餾提取法進行比較，實驗結(jié)果列于表1。由表1 可見，與鹽析-水蒸氣蒸餾提取法相比，超聲波輔助提取法可在一定程度上縮短葛縷子精油的提取時間，同時葛縷子精油得率也比傳統(tǒng)提取法提高了1.24%。這是由于一定頻率的超聲波產(chǎn)生的強烈空化效應和次級效應(如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等)可使細胞壁破裂，提高萃取成分分子的運動速度和頻率，增強溶劑穿透力，從而使萃取成分與溶劑充分混合，加大了萃取的效率，同時，超聲可促進溶劑與活性成分的雙向轉(zhuǎn)移，提高得率，縮短提取時間。由此可見，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法相比，超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取葛縷子精油不僅可以縮短提取時間，還可以提高精油產(chǎn)率。

表1 超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取法與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法的比較Table 1 Comparison between ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction(UASHDE)and salting-out hydrodistillation extraction(SHDE)

2.8 葛縷子精油的揮發(fā)性成分

按照1.5 節(jié)的氣相色譜-質(zhì)譜條件對兩種方法提取的葛縷子精油進行分析。根據(jù)葛縷子精油的總離子流圖，用GC-MS 儀NIST98 譜庫自動檢索被分析組分的質(zhì)譜，并對檢索結(jié)果進行人工核對。成分的鑒定結(jié)果及各化合物的質(zhì)量分數(shù)見表2(質(zhì)量分數(shù)利用毛細管氣相色譜面積歸一化法計算)。

據(jù)表2 可知，分別鑒定出27(超聲波處理)和15(直接蒸餾)種化合物，鑒定成分占各自提取成分總峰面積的比例分別為99.98%和99.92%。兩種方法提取的葛縷子精油中主要成分有β-月桂烯、檸檬烯、二氫香芹酮、香芹醇、右旋香芹酮、紫蘇醛等。其中右旋香芹酮質(zhì)量分數(shù)最高，分別占總質(zhì)量分數(shù)的76.29%和66.42%，然后是檸檬烯，分別占總質(zhì)量分數(shù)的21.84%和31.08%。雖然最主要的成分都是右旋香芹酮和檸檬烯，這與閻卉等［20］、ISIDORA 等［5］的實驗結(jié)果相一致，但在含量上卻存在比較大的差異，這與Rivera 等［4］的報道相一致，因為提取方法對葛縷子精油的組成成分有較大的影響。姜子濤等［8］采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取葛縷子精油，GC-MS分析結(jié)果表明，其主要成分是芹菜腦(12.3%)、右旋香芹酮(31.3%)和檸檬烯(48.4%)。另外，從表2 發(fā)現(xiàn)，超聲處理后，一些微量的功效成分如β-水芹烯、1，3，8-對-薄荷三烯、香芹酚、香葉酸甲酯等都可被蒸餾獲得，這可能與超聲處理加速葛縷子精油成分的滲出從而加速蒸餾過程降低精油揮發(fā)損失有關(guān)，由此可見，超聲輔助的鹽析-水蒸氣蒸餾法提取的葛縷子精油質(zhì)量更高。

3 結(jié)論

本文在UASHDE 提取葛縷子精油的研究中，確定最適提取條件為:料液比1 ∶15，氯化鈉濃度為15%，浸泡時間60min，超聲頻率25kHz，超聲功率250W，超聲時間30min。在最佳條件下進行提取實驗，葛縷子精油得率為5.42% ±0.01%，比SHDE 提取結(jié)果提高了 1.24%，時間也從 90min 縮短到75min。

UASHDE 和SHDE 提取的葛縷子精油中主要成分有β-月桂烯、檸檬烯、二氫香芹酮、香芹醇、右旋香芹酮、紫蘇醛等，其中右旋香芹酮和檸檬烯含量較高，分別為66.42%和76.29%，31.08%和21.84%，是葛縷子的主要有效成分。

表2 超聲輔助水蒸氣蒸餾法提取葛縷子精油的成分Table 2 Analysis results of caraway essential oils constituents obtained by UASHDE and SHDE

UASHDE 對葛縷子精油中熱不穩(wěn)定和易揮發(fā)性化合物有更好的提取效果。

上述研究結(jié)果表明，UASHDE 提取葛縷子精油不僅可以縮短提取時間，提高精油得率，還可以改善精油的質(zhì)量。

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