吳華玉，劉敦華*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)是茄科(Solanaceae)落葉小灌木的成熟果實，是我國傳統(tǒng)的中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。枸杞既可作為堅果食用，又是一味功效卓著的傳統(tǒng)中藥材，《本草綱目》述“枸杞久服，補精氣不足，易容顏變白，明目安神”，令人長壽故又名“不老子”[1]。

目前，國內(nèi)對于寧夏枸杞或枸杞營養(yǎng)成分的分析研究主要在枸杞多糖、維生素、甜菜堿及黃酮類；枸杞籽也主要用來提取枸杞籽油[2]。對于枸杞蛋白這一重要營養(yǎng)成分的研究較少，且多側(cè)重于其穩(wěn)定性的研究。已知寧夏枸杞全果粗蛋白含量10.6%左右，寧夏分析測試中心測出寧夏枸杞子中含18種氨基酸，其中8種是人體必需的氨基酸(如異亮氨酸、色氨酸等)，寧夏枸杞果實中游離氨基酸占氨基酸總量的50%以上[3]。但寧夏枸杞籽中蛋白的含量和功能特性還未見報道。

寧夏枸杞中籽占全果的15%～20%，枸杞籽含油18%左右[1]?；趯幭蔫坭降莫毺乇＝」δ?，其籽的抗氧化生物特性更是得到廣泛認(rèn)同[1]，寧夏自治區(qū)生產(chǎn)寧夏枸杞籽油的規(guī)模越來越大，技術(shù)也越來越成熟。生產(chǎn)寧夏枸杞籽油的枸杞籽主要來源于生產(chǎn)寧夏枸杞鮮汁的副產(chǎn)品，枸杞籽粕作為枸杞籽取油后副產(chǎn)物，利用相當(dāng)有限，僅用于飼料或肥料，或者直接丟棄，這造成了枸杞籽粕資源的極大浪費。經(jīng)作者測定寧夏枸杞籽粕的蛋白含量在24%～30%，具有較高利用價值。在寧夏回族自治區(qū)域枸杞和枸杞籽粕資源豐富的條件下，從大量廉價的寧夏枸杞籽粕中提取食用蛋白和功能肽，充分開發(fā)利用其中的蛋白質(zhì)資源，對提升我區(qū)枸杞特色產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品的發(fā)展，緩解我國優(yōu)質(zhì)蛋白和功能肽需求有著重大的意義。為了充分利用這個極其巨大的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，本實驗對超臨界CO2萃取寧夏枸杞籽油后的枸杞籽粕進(jìn)行分離蛋白的提取和功能性質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來源于2009年中寧產(chǎn)寧夏枸杞，經(jīng)超臨界CO2萃取枸杞籽油后得到的枸杞籽粕。

氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、氯化鈉均為分析純；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ-3F實驗室pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；79-1磁力加熱攪拌器、JJ-2型組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；HZS-HA水浴振蕩器 哈爾濱市東民醫(yī)療儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；JDG-0.2真空凍干試驗機 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；DYY-6D型電泳儀電源、DYCZ-24系列雙垂直蛋白電泳儀 北京市六一儀器廠；UDK127 Distillation、DK6 Heating Digester 意大利Velp公司；L-8800全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 工藝流程

1.4 具體操作

1.4.1 原料預(yù)處理 枸杞籽粕粉碎過80目制得實驗樣品，置于干燥器中貯藏備用。

1.4.2 堿提酸沉法制備枸杞籽分離蛋白及蛋白得率計算[4-6]稱取一定量的枸杞籽粕，在一定料液比條件下調(diào)節(jié)pH值，控制溫度和攪拌速率，提取60min，將料液在3000r/min條件下離心5min，得到蛋白提取液。再調(diào)節(jié)提取液的pH值，使其在等電點處沉淀，3000r/min條件下離心10min得到枸杞籽分離蛋白，水洗為中性后真空冷凍干燥，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩０词?1)計算蛋白得率。

1.4.3 指標(biāo)測定

粗蛋白含量的測定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》，微量凱氏定氮法；水分的測定：GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》，直接干燥法；灰分的測定：GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》，干法灰化；單寧的測定：SN/T 0800.9—1999《進(jìn)出口糧食、飼料單寧含量檢驗方法》；殘油的測定：魯氏殘余法。

1.4.4 枸杞籽蛋白氨基酸含量測定

采用GB/T 14965—1994《食品中氨基酸的測定方法》，酸水解法測定。蓮子粉及蓮子主要蛋白組分提取液用6mol/L鹽酸，110℃水解24h后減壓蒸干，采用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸(Trp)以外的17種氨基酸。

1.4.5 必需氨基酸組成模式測定[7]

將枸杞籽分離蛋白中的色氨酸含量定為1.0，分別計算出其他必需氨基酸的對應(yīng)比值，構(gòu)成該種蛋白質(zhì)必需氨基酸組成模式。

1.4.6 枸杞籽分離蛋白功能性質(zhì)的研究[8-9]

1.4.6.1 溶解性

分別準(zhǔn)確稱取0.1000g樣品，加20mL蒸餾水溶解，裝入6支50mL離心管中，分別調(diào)節(jié)pH值為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，室溫靜置30min。然后在一定溫度下攪拌浸提30min，在3000r/min離心10min后取上清液，用微量凱氏定氮法測定上清液中樣品及未處理樣品中的含氮量。按式(2)計算氮溶解指數(shù)(NSI)。

1.4.6.2 吸油性

稱取0.3g的枸杞籽蛋白樣品放入15mL刻度離心管中，加入2.0mL大豆色拉油，攪拌均勻，室溫靜置30min后，2000r/min離心10min，讀出游離油的體積，吸油性以每克蛋白質(zhì)吸附油的毫升數(shù)表示，按式(3)計算。

1.4.6.3 持水性

稱取枸杞籽蛋白樣品0.5g，加入20mL水，攪拌均勻后靜置20min，使之充分吸水，1500r/min離心5min，去除分離水，測定殘留物的質(zhì)量，以每克蛋白樣品干質(zhì)量吸附水的克數(shù)表示，按式(4)計算。

1.4.6.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性

稱取一定量的蛋白樣品溶解到50mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7.0，加入50mL大豆油，于10000r/min的組織搗碎勻漿機中均質(zhì)5min。取一定量液體注入離心管中，1500r/min離心10min，在室溫條件下以離心后乳化層占總液體的體積百分?jǐn)?shù)來計算乳化性，按式(5)計算。

將上述所得乳化物在90℃條件下水浴30min，冷卻至室溫，1500r/min離心5min，以殘留乳化層占原乳化層的百分?jǐn)?shù)來表示乳化穩(wěn)定性，按式(6)計算。

1.4.6.5 起泡性及起泡穩(wěn)定性

稱取一定量的蛋白樣品，溶解到200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7.0，然后在10000r/min的組織搗碎機中均質(zhì)5min，然后倒入500mL量筒中，在室溫條件下記錄勻質(zhì)停止時泡沫的體積，按式(7)計算起泡性。

均質(zhì)停止5、10、30min后記錄泡沫體積，按式(8)計算起泡穩(wěn)定性。

1.4.7 枸杞籽分離蛋白的分子質(zhì)量測定[10-12]

采用不連續(xù)的SDS-PAGE垂直電泳法進(jìn)行測定。采用pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl緩沖液、10%分離膠和pH6.8的1.0mol/L Tris-HCl緩沖液、5%濃縮膠。濃縮膠電壓為70mV，分離膠電壓140mV。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，最后用10%甲醇和10%冰乙酸的水溶液脫色至背景清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 組成成分分析

表 1 枸杞籽分離蛋白的組分Table 1 Compositions of Lycium barbarum L. seed protein isolate

枸杞籽粕經(jīng)過堿提酸溶、真空凍干后所制得的分離蛋白呈淡乳黃色粉末，黏性較大，易吸潮，有淡淡的苦味和蛋白的香味，其組成成分見表1，分離蛋白得率為85.67%。可以看出，枸杞籽蛋白的水分含量偏高，這可能是枸杞籽分離蛋白結(jié)構(gòu)松散，易吸潮。蛋白灰分較低，抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧去除率高，殘油含量正常。

2.2 枸杞籽分離蛋白氨基酸分析

表 2 枸杞籽分離蛋白的氨基酸分析Table 2 Amino acid compositions of Lycium barbarum L. seed protein isolate mg/100mg

表 3 枸杞籽分離蛋白的必需氨基酸組成模式Table 3 Essential amino acid patterns of Lycium barbarum L. seed protein isolate

由表2、3可知，枸杞籽分離蛋白含有人體必需的8種氨基酸，EAA占總氨基酸的38.23%。對比大豆分離蛋白、蓮子水溶蛋白和菜籽粕貯藏球蛋白的氨基酸組成可以看出，枸杞籽分離蛋白的氨基酸組成和含量與菜籽粕貯藏球蛋白較為接近。枸杞籽分離蛋白的氨基酸組成較平衡，只有蛋氨酸和胱氨酸含量較低，其他氨基酸比例都很合適。谷氨酸和天冬氨酸含量很高，特別是谷氨酸含量達(dá)到9.38mg/100mg，這2種物質(zhì)對人的腦神經(jīng)發(fā)育和增強記憶具有良好的作用。亮氨酸和精氨酸等功能性氨基酸含量也相對較高，這說明芳香族氨基酸與含硫氨基酸同樣含量豐富。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等支鏈氨基酸含量豐富，這對運動員骨骼肌的能量供應(yīng)，肌肉合成以及延緩中樞疲勞均有極大的幫助[13]。

與FAO/WHO必需氨基酸模式相比，蛋氨酸為其第一限制氨基酸，整體氨基酸組成均略低于FAO/WHO模式，但比例較平衡，具有一定的營養(yǎng)價值，可以考慮進(jìn)一步加工制作成為食用蛋白，作為營養(yǎng)食品或加工食品的配料，充分利用區(qū)域特色，帶動區(qū)域工業(yè)發(fā)展。

2.3 枸杞籽分離蛋白的功能性質(zhì)

所謂功能特性，是指枸杞籽分離蛋白在配制、加工、貯藏和制取過程中的理化性質(zhì)，包括溶解性、組織形成性、吸水性、保水性、膨潤性、乳化性、吸油性、黏度、膠凝性、起泡性等，其功能特性的優(yōu)劣取決于蛋白質(zhì)本身的大小與結(jié)構(gòu)、環(huán)境因素(濃度、pH值、離子強度等)以及其他成分(水、糖、氣味等)的存在[14-16]。

2.3.1 枸杞籽分離蛋白的溶解性

蛋白的溶解性是蛋白重要的功能特性之一，溶解性的高低直接影響到其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因為蛋白質(zhì)的水溶性對其在食品工業(yè)中的穩(wěn)定性、風(fēng)味等有直接的影響，不溶性蛋白質(zhì)在食品中的應(yīng)用是非常有限的[17-18]。

圖 1 pH值對蛋白溶解性的影響Fig.1 Effect of pH on protein solubility

由圖1可知，傳統(tǒng)堿提酸沉法提取的枸杞籽分離蛋白其溶解性基本呈“V”型。在pH2～8之間枸杞籽的蛋白都有一定的溶解性，在等電點pH4.5時其溶解性最低，在pH7.5處溶解性最大，達(dá)到85%。

2.3.2 枸杞籽分離蛋白的其他功能特性

吸油性是指蛋白質(zhì)吸附油的能力，它與蛋白質(zhì)的加工方法、粒度、溫度及所用油脂有關(guān)。蛋白質(zhì)的吸水性與食品的黏度有關(guān)，它受pH值、溫度、離子強度等因素的影響。乳化性是指蛋白將油水結(jié)合在一起形成乳化液的性能，影響的乳化性因素很多，主要是制品的蛋白質(zhì)含量、氮溶解指數(shù)、蛋白質(zhì)中碳水化合物有關(guān)。乳化穩(wěn)定性是指油水乳化液保持穩(wěn)定的能力。起泡性是指蛋白質(zhì)在加工中體積的增加率,可起到酥松作用[19]。泡沫是由一個連續(xù)的水相和一個分散的氣相所組成。蛋白質(zhì)起泡能力主要取決于其可溶部分，蛋白質(zhì)高溶解性是良好的起泡能力和穩(wěn)定性的先決條件[20]，但不溶解的蛋白質(zhì)粒子在穩(wěn)定泡沫中也能起著有益作用。

表 4 枸杞籽分離蛋白的功能特性Table 4 Functional properties of Lycium barbarum L. seed protein isolate

由表4可知，枸杞籽分離蛋白具有非常好的吸油性和乳化性。根據(jù)大豆乳化性在食品中的應(yīng)用，枸杞籽蛋白可以用于促進(jìn)脂肪吸收或與脂肪結(jié)合的目的，起到乳化的作用。其吸油性可以用來加入肉制品中，減少肉制品加工過程中脂肪和汁液的損失，有助于維持外形的穩(wěn)定[21]；還可以廣泛地應(yīng)用到火腿腸、面包圈等食品中。結(jié)果還表明，枸杞籽蛋白的持水性一般，起泡性不太好，但是其溶解性較好，這可能與蛋白濃度和提取溫度有關(guān)[22]。其起泡穩(wěn)定性較高，與高溶解性有關(guān)[21]?？梢钥紤]繼續(xù)研究枸杞籽蛋白的起泡性，作為發(fā)泡劑用于工業(yè)生產(chǎn)中。

總之，枸杞籽分離蛋白具有良好的功能特性，可以對其進(jìn)行修飾和改良，研發(fā)寧夏枸杞的營養(yǎng)特性[23]。

2.4 枸杞籽分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

圖 2 枸杞籽分離蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE of Lycium barbarum L. seed protein isolate

圖 3 不同pH值沉淀的枸杞籽分離蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of Lycium barbarum L. seed protein isolate at various pH

由圖2可知，枸杞籽分離蛋白條帶分布均勻，出現(xiàn)了6條分布均勻的亞基條帶，其分子質(zhì)量主要分布在17～55kD。枸杞籽分離蛋白電泳圖譜主要分為2個集中區(qū)域，上方區(qū)域有分子質(zhì)量分別為48、35、32kD的3個主帶；下方區(qū)域出現(xiàn)3條主帶，根據(jù)遷移率計算分子質(zhì)量約為20.4、19、18.5kD。其中分子質(zhì)量為48kD的蛋白組分比較單一，分子質(zhì)量為35、32kD的蛋白含量比較高。由圖3可知，沉淀的pH值不影響枸杞籽分離蛋白的組分，這為以后的枸杞功能肽的提取純化打下基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

寧夏枸杞籽分離蛋白的氨基酸組成較平衡，蛋氨酸為第一限制氨基酸，谷氨酸含量偏高，具有較高的利用價值；寧夏枸杞籽分離蛋白的吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性和氣泡穩(wěn)定性良好，溶解性和持水性一般，起泡性則相對較差，可開發(fā)寧夏枸杞的營養(yǎng)特性，對枸杞籽分離蛋白進(jìn)行改良，研發(fā)保健食品或食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)中；寧夏枸杞籽分離蛋白主要由6種不同分子質(zhì)量的蛋白亞基組成，其分子質(zhì)量分別為48、35、32、20.4、19、18.5kD。

以超臨界CO2萃取枸杞籽油后得到的枸杞籽粕為原料生產(chǎn)分離蛋白，利用其優(yōu)良的功能特性生產(chǎn)為食品添加劑，以及在此基礎(chǔ)上開發(fā)蛋白質(zhì)新產(chǎn)品，有著極其廣闊的市場前景。目前，還有諸多問題尚在研究之中，如提取工藝的進(jìn)一步優(yōu)化，獲得更高純度的蛋白；功能性活性肽的開發(fā)中，枸杞籽多肽分子的氨基酸序列的確定，生物活性如抗氧化、降血脂等功能的探討，以及分離提純等下游工程的研究。因此，以枸杞籽粕生產(chǎn)枸杞籽分離蛋白等一系列產(chǎn)品有著深入研究的價值。

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