蘇 翔，崔敬愛(ài)，陳曉平

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

抗菌肽是一類活性小肽，廣泛存在于生物體內(nèi)。它具有抗菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、種類多、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等特點(diǎn)[1-2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)各類抗菌肽的研究取得很大進(jìn)展，在很多微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性的今天，抗菌肽將會(huì)成為新一代的臨床抗菌藥物，在化妝品、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑和動(dòng)植物抗病基因工程方面也將有著廣闊的應(yīng)用前景[3-6]。螞蟻體內(nèi)含有特殊的“螞蟻抗生素”[7]。此外，螞蟻還有生活適應(yīng)能力強(qiáng)、世代周期短、繁殖力高等生物學(xué)特點(diǎn)，故研究螞蟻抗菌肽的分離純化工藝對(duì)開(kāi)拓螞蟻抗菌肽資源具有重要意義[8-9]。本研究通過(guò)對(duì)螞蟻抗菌肽的分離純化及某些抗菌活性的研究，為以后開(kāi)展此項(xiàng)研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螞蟻，購(gòu)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)立新參茸店。

乙醇(分析純) 北京化工廠；葡聚糖凝膠柱Sephadex G-25 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(SM1891) 加拿大Fermentas公司；測(cè)試菌株 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程教研室提供。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基：參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中培養(yǎng)基配方配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；XA-1組織粉碎機(jī) 金壇市科析儀器有限公司；DY89-1電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21LM高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DYY-11電泳儀 北京市六一儀器廠；電子恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗提物的制備

將螞蟻洗凈，放在托盤(pán)內(nèi)攤平。將托盤(pán)放入真空干燥箱，在40℃條件下烘干至質(zhì)量恒定。用組織粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩得螞蟻粉。取10g螞蟻粉按料液比1：30(m/V)加入60%乙醇，用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿后在4℃條件下浸提24h。濾紙過(guò)濾，將提取液在4℃、7000r/min條件下離心20min，取上清液，于－80℃冰箱凍藏，得螞蟻抗菌肽粗提液。將粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇，真空冷凍干燥制成褐色粉末，即螞蟻抗菌肽的粗提物。

1.3.2 螞蟻抗菌肽的純化

參考陸婕等[10]方法，采用加熱-層析法對(duì)螞蟻抗菌肽粗提液進(jìn)行分離純化。將粗提液置于100℃水浴中保溫20min，然后在4℃、15000r/min條件下離心30min，收集沉淀，得熱變性蛋白記為a，將上清液冷凍干燥，得到干物質(zhì)記為b。對(duì)熱變性蛋白a及干物質(zhì)b進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其有無(wú)抑菌活性。將有抑菌活性的干物質(zhì)b溶于5mL去離子水上柱，以濃度為0.05mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，進(jìn)行Sephadex G-25柱層析分離。用自動(dòng)部分收集器收集，設(shè)定12min收集1管。用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處測(cè)其吸光度，收集洗脫峰，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，有抑菌作用的峰值管里物質(zhì)即為螞蟻抗菌肽的提純物。

1.3.3 螞蟻抗菌肽的抑菌活性

1.3.3.1 抑菌活性檢測(cè)

采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法[11]，以大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)為受試菌。將大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，振蕩后放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，活化2～3次。將加熱融化的LB固體培養(yǎng)基15mL注入到平皿中，待凝固后，吸取菌濃為103CFU/mL的2種受試菌液各100μL加入不同平皿[12]，涂布均勻。在培養(yǎng)基已挖好的孔洞里加入40μL提取液，并做陰性、陽(yáng)性對(duì)照。其中陰性對(duì)照為蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)量濃度100μg/mL的氨芐青霉素溶液。置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果，測(cè)量抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.3.2 SDS-PAGE檢測(cè)

配制5mL 15%分離膠和2mL 5%濃縮膠，電泳開(kāi)始時(shí)，在80V電壓下電泳30min左右，待指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，將電壓調(diào)至130V，至藍(lán)色指示前沿至分離膠3/4位置時(shí)停止電泳。將膠置于5%戊二醛溶液中固定30min，再經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色1h，脫色過(guò)夜，直至顯現(xiàn)出清晰的蛋白質(zhì)條帶[13]。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定抗菌肽分子質(zhì)量

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。根據(jù)樣品蛋白質(zhì)在電泳圖譜上的相對(duì)遷移率，計(jì)算出其分子質(zhì)量。

1.3.3.4 最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定

采用微量液體檢測(cè)法[15]，對(duì)定量的螞蟻抗菌肽提純物作2倍遞減濃度稀釋，分別為0.020312、0.040625、0.08125、0.1625、0.325、0.65、1.3mg/mL，對(duì)大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、腸炎沙門(mén)氏菌(ATCC 13076)、枯草芽孢桿菌(ATCC 11060)做抑菌實(shí)驗(yàn)，抑菌圈直徑在10mm以上的為最小抑菌質(zhì)量濃度[16]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.3.5 耐熱性檢測(cè)

將螞蟻抗菌肽配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的溶液，在80、100、121℃條件下分別加熱30min，對(duì)大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，觀察抑菌圈直徑變化，以未經(jīng)加熱的抗菌肽溶液為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G-25柱層析分離結(jié)果

圖 1 變性蛋白a及干物質(zhì)b對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic capacity of denatured protein a and dry material b on to Escherichia coli and Staphylococcus aureus

由圖1可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照氨芐青霉素溶液對(duì)大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈明顯，而陰性對(duì)照蒸餾水則無(wú)抑菌圈。與氨芐青霉素溶液與蒸餾水對(duì)照，熱變性蛋白a對(duì)大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌均無(wú)抑菌作用，干物質(zhì)b則對(duì)兩種細(xì)菌抑菌作用明顯，可見(jiàn)加熱能除去不耐熱蛋白，有利于耐熱性好的抗菌肽的分離。

干物質(zhì)b經(jīng)Sephadex G-25柱層析分離后，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280nm處測(cè)其吸光度，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)，抗菌肽在第30和31號(hào)收集管中。

圖 2 Sephadex G-25柱層析分離結(jié)果Fig.2 Chromatographic separation of antimicrobial peptide on Sephadex G-25 column

2.2 SDS-PAGE電泳測(cè)分子質(zhì)量

圖 3 樣品的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of antimicrobial peptide samples

將經(jīng)加熱-層析法得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量。電泳圖如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，經(jīng)加熱-層析法所制得的樣品在膠上表現(xiàn)為單一蛋白條帶。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程y=－2.6865x＋2.1712(R2=0.9869)，計(jì)算出螞蟻抗菌肽提純物的分子質(zhì)量為3.746kD。

2.3 螞蟻抗菌肽提純物的最小抑菌質(zhì)量濃度

表 1 螞蟻抗菌肽的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of antimicrobial peptides from ants

由表1可知，螞蟻抗菌肽對(duì)4種細(xì)菌都有一定的抑菌效果，對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.325、0.65、0.1625、0.325mg/mL。

2.4 螞蟻抗菌肽的耐熱性

圖 4 不同溫度加熱對(duì)螞蟻抗菌肽抑菌效果的影響Fig.4 Bacteriostatic effect of peptides from ants subjected to heating treatment at various temperatures

由圖4可知，螞蟻抗菌肽在80℃和100℃加熱后對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌活性變化不大，在121℃抑菌活性出現(xiàn)下降，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性隨加熱溫度增大有所增強(qiáng)?？梢?jiàn)螞蟻抗菌肽具有較好的耐熱性。

3 討 論

抗菌肽對(duì)很多致病菌均具有抑菌作用，具有廣譜抑菌效果。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行了大量研究，且取得了很大進(jìn)展[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離純化出的螞蟻抗菌肽對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌均具有很好的抑菌效果。至于螞蟻抗菌肽對(duì)于其他致病菌和腫瘤細(xì)胞有無(wú)抑制及殺傷作用有待今后進(jìn)一步研究。

螞蟻抗菌肽的提純工藝目前處于實(shí)驗(yàn)研究階段，較難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)在分離純化過(guò)程中，利用抗菌肽的耐熱性，采用加熱-層析法得到了螞蟻抗菌肽提純物，相比其他傳統(tǒng)提純工藝，大大簡(jiǎn)化了工藝步驟，在大規(guī)模生產(chǎn)中將會(huì)降低企業(yè)生產(chǎn)成本，且加熱能使外源性蛋白酶變性失活，避免抗菌肽發(fā)生降解，有利于在生產(chǎn)中保證其質(zhì)量和穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)未對(duì)螞蟻抗菌肽提純物進(jìn)行氨基酸組成和結(jié)構(gòu)分析，有待于進(jìn)一步研究。

螞蟻的世代周期短、繁殖力高等生物學(xué)特點(diǎn)決定了其資源豐富且價(jià)格低廉，從螞蟻中提取抗菌肽仍具有較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

經(jīng)乙醇浸提和加熱層析，得到純度較高、耐熱性好的螞蟻抗菌肽。其分子質(zhì)量為3.746kD。螞蟻抗菌肽對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.325、0.65、0.1625、0.325mg/mL。

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