蘆蒿秸稈總黃酮富集純化及產(chǎn)物鑒定

鄧榮華，郭宇星，李曉明，呂麗爽*

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

蘆蒿(Artemisia selengensis Turcz)為菊科蒿屬植物，又名藜蒿、柳蒿、香艾蒿、狹葉艾等，為多年生草本植物。《神農(nóng)本草經(jīng)》把其列為“上品，甘、平，無毒，長毛發(fā)令黑，療心懸，少食常饑，久服輕身，耳目聰明，防衰之功效”。《本草綱目》記為“主治五臟邪氣，風(fēng)寒濕脾，補(bǔ)中氣，利膈開胃，可去東河豚毒”[1]。蘆蒿風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富,且含有較多的黃酮類物質(zhì)[2]，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化性，可以清除活性氧自由基，抑制產(chǎn)生自由基的某些酶的活性等功能[3-9]，開發(fā)前景廣闊。蘆蒿的藥用價(jià)值有清熱、去風(fēng)濕、開胃等功效。民間也有用于治療急、慢性傳染性肝炎者，效果較好[10]。蘆蒿在南京八卦洲的種植面積達(dá)到3萬畝，年產(chǎn)量約5300萬kg，由于在生長末期極易木質(zhì)化，八卦洲每年產(chǎn)生的木質(zhì)化蘆蒿秸稈達(dá)2000萬kg，種植戶采用焚燒的方式對(duì)其進(jìn)行處理，造成了環(huán)境污染。因此，為提高蘆蒿綜合利用價(jià)值，開展蘆蒿研究很有必要，同時(shí)，分離純化獲得高純度的蘆蒿秸稈總黃酮是新藥開發(fā)的重要前提。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)選出較理想的大孔樹脂AB-8對(duì)蘆蒿秸稈總黃酮進(jìn)行富集純化，并對(duì)純化后產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定，以期為蘆蒿秸稈的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆蒿秸稈購于南京八卦洲，干燥粉碎后備用。

AB-8大孔樹脂 天津南開大學(xué)化工廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、濃鹽酸、甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C-01 pH計(jì) 上海三信儀表廠；WFH-201B紫外透射反射儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；HYG-C多功能搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；電腦全自動(dòng)部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；UV-6100A型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆蒿秸稈總黃酮粗提液的制備[11]

蘆蒿秸稈→干燥粉碎→乙醇回流提取→冷卻→抽濾→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→蘆蒿秸稈總黃酮粗提液

1.3.2 蘆蒿秸稈總黃酮的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)[13-14]

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量(含干樹脂1.0013g左右)的經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂，置于150mL錐形瓶中，加入蘆蒿秸稈提取液(1.790mg/mL)50mL，封口，置于恒溫25℃搖床中，以140r/min速率進(jìn)行吸附，每隔一定時(shí)間取樣并測(cè)定吸附后原液中總黃酮質(zhì)量濃度。當(dāng)樹脂吸附平衡后，將樹脂過濾，用蒸餾水洗去樹脂表面的總黃酮溶液后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇50mL于25℃振蕩解吸，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，分別計(jì)算樹脂的吸附量及解吸量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以每克樹脂中總黃酮的吸附量及解吸量為縱坐標(biāo)繪制吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線，按式(1)～(3)分別計(jì)算吸附率、吸附量、解吸率和解吸量。

式(1)～(4)中：Co為吸附前溶液的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；Ce為吸附后溶液的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V1為溶液的體積/mL；V2為解吸液體積/mL；E為吸附率/%；Qe為吸附量/mg；D為解吸率/%；Qd為解吸量/mg；Cd為解吸液總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)。

1.3.4 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附

1.3.4.1 上樣液pH值對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附率的影響[15]

采用規(guī)格為1.5cm×60cm的層析柱，將處理好的樹脂濕法裝柱，取相同體積的蘆蒿秸稈提取物，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)上樣液pH值分別為3.02、4.08、5.00、6.06、7.02，以1mL/min流速上柱，吸附完全后，用2.0BV的蒸餾水洗柱，再用2.0BV 70%乙醇以1mL/min速率洗脫，將洗脫液濃縮，測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹脂吸附率。探討pH值與AB-8吸附率的關(guān)系，以確定純化工藝中最適的上樣液pH值。

1.3.4.2 上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附效果的影響[16]

量取已知總黃酮質(zhì)量濃度的蘆蒿秸稈提取液，分別用去離子水配制成上樣質(zhì)量濃度和體積分別為0.738mg/mL和16mL、1.476mg/mL和8mL、2.952mg/mL和4mL、5.903mg/mL和2mL的溶液，其余操作同1.3.4.1節(jié)，探討上樣質(zhì)量濃度對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)吸附效果的影響，以確定最合適的上樣質(zhì)量濃度。

1.3.4.3 上樣量的確定[17]

將預(yù)處理過的樹脂濕法裝柱(柱體積為60cm3)，在上述確定的最適條件下，以1mL/min的流速連續(xù)上柱，每7mL收集一管，測(cè)定每管中總黃酮質(zhì)量濃度隨流出體積的變化。將流出液中總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到入口濃度10%的點(diǎn)，作為柱子的穿透點(diǎn)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的上樣量為最大上樣量。以流出液累積體積為橫坐標(biāo)，流出液總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制蘆蒿秸稈總黃酮的泄露曲線。

1.3.5 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸

1.3.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8動(dòng)態(tài)解吸效果的影響[18]

加入相同體積的上樣液，在其他條件一致的情況下，分別用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫，比較不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)AB-8解吸效果的影響，以確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.5.2 洗脫劑用量的確定[17]

將一定體積的上樣液按最佳條件上柱后，用蒸餾水沖洗到流出液為無色，按最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫，10mL/管收集，同時(shí)測(cè)定各個(gè)管中的總黃酮質(zhì)量濃度，繪制蘆蒿秸稈總黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.3.6 AB-8柱純化前后總黃酮純度的比較[19]

按上述最佳條件進(jìn)行AB-8柱層析實(shí)驗(yàn)，收集洗脫液，濃縮凍干，得到初步純化產(chǎn)物，即蘆蒿秸稈總黃酮粗品(簡(jiǎn)稱黃酮粗品)。將上柱前蘆蒿秸稈黃酮粗提物濃縮液冷凍干燥，得到黃酮粗提物。分別測(cè)定和計(jì)算總黃酮純度。

1.3.7 AB-8純化產(chǎn)物的初步鑒定

1.3.7.1 顯色反應(yīng)[20]

分別進(jìn)行還原實(shí)驗(yàn)、金屬鹽類絡(luò)合反應(yīng)、堿性顯色反應(yīng)、硼酸顯色反應(yīng)，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.3.7.2 紫外吸收光譜分析[21]

將純化后的樣品甲醇溶液在200～600nm進(jìn)行紫外掃描，繪制“MeOH圖譜”，觀察特征吸收峰。

在黃酮類化合物溶液中加6滴AlCl3試劑，混合均勻后，進(jìn)行紫外掃描，繪制“AlCl3圖譜”，然后加入3滴HCl溶液，混合均勻，進(jìn)行紫外掃描，繪制“AlCl3/HCl圖譜”。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)

圖 1 AB-8樹脂的靜態(tài)吸附及解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption and static desorption curves of AB-8 resin

由圖1可知，0～3.5h內(nèi)，隨著吸附時(shí)間的延長，AB-8樹脂吸附總黃酮量增加，1.5h已經(jīng)基本達(dá)到吸附飽和，吸附量達(dá)67.14mg/g樹脂，3.5h后達(dá)到飽和吸附量70.56mg/g樹脂，說明AB-8樹脂屬于快速平衡型樹脂。由解吸動(dòng)力學(xué)曲線可知，在0.5h時(shí)，AB-8大孔樹脂解吸量為65.43mg/g樹脂，1.5h時(shí)達(dá)到最大解吸量66.77mg/g樹脂。結(jié)果表明，AB-8樹脂不僅具有較高的吸附量和解吸量，而且能快速地達(dá)到吸附平衡和解吸平衡，是富集純化蘆蒿秸稈總黃酮的理想樹脂。

2.2 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附

2.2.1 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響

圖 2 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effect of sample pH value on adsorption effi ciency

由圖2可知，上樣液pH值對(duì)樹脂吸附性能影響較大，pH3.02時(shí)吸附率較低，這可能是由于黃酮類化合物在強(qiáng)酸環(huán)境條件下常轉(zhuǎn)化為佯鹽，不容易被吸附上，使得吸附率降低；吸附率在pH4.08時(shí)達(dá)到最大，但隨著pH值的進(jìn)一步增大，樹脂的吸附容量反而下降，可能原因是黃酮類化合物帶有酚羥基，呈弱酸性，故在微酸性條件下吸附較好。

2.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附量的影響

圖 3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption effi ciency

由圖3可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度增加，吸附量增大，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.476mg/mL時(shí)吸附量最大，為10.36mg。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加時(shí)，吸附量已飽和，過高的樣品質(zhì)量濃度，反而會(huì)影響吸附效果，使得吸附量有所減少。這是因?yàn)榭傸S酮質(zhì)量濃度較低時(shí)，提高總黃酮質(zhì)量濃度可增加黃酮分子與樹脂的接觸，加速黃酮分子進(jìn)入樹脂內(nèi)部并迅速擴(kuò)散，但隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，與黃酮競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)量也隨之加大，影響黃酮分子在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散，導(dǎo)致樹脂吸附量有所下降。因此，最佳的上樣質(zhì)量濃度應(yīng)控制在1.476mg/mL左右。

2.2.3 上樣量的確定

圖 4 AB-8樹脂泄漏曲線Fig.4 Leakage curve of AB-8 resin

由圖4可知，當(dāng)上柱液體積達(dá)到70mL時(shí)，蘆蒿秸稈黃酮開始出現(xiàn)明顯的泄漏。隨著流出液體積的增加，流出液的總黃酮質(zhì)量濃度逐漸增大，當(dāng)流出液體積增至98mL時(shí)，泄漏曲線趨于平緩，即此時(shí)AB-8大孔樹脂對(duì)蘆蒿秸稈黃酮的動(dòng)態(tài)吸附達(dá)到飽和，由此，可確定蘆蒿秸稈黃酮提取液最大上柱體積為樹脂體積的2.5倍。

2.3 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

圖 5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)動(dòng)態(tài)解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption effi ciency

由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～80%時(shí)，對(duì)AB-8樹脂解吸率影響不大，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過低或過高時(shí)，解吸率卻明顯下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%左右時(shí)，解吸率最大，可能是由于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇的極性和蘆蒿秸稈總黃酮的極性更加接近，根據(jù)相似相溶的原理，體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇的解吸率較高。

2.3.2 洗脫劑用量的確定

圖 6 AB-8樹脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.6 Dynamic elution curve of AB-8 resin

由圖6可知，AB-8樹脂對(duì)蘆蒿秸稈黃酮有很好的洗脫能力。樹脂上吸附的黃酮物質(zhì)極易洗脫，洗脫峰比較集中，當(dāng)洗脫體積為50～70mL時(shí)，洗脫液中的總黃酮含量最高。洗脫劑用量為1.5BV時(shí)，黃酮基本被完全洗脫，在此基礎(chǔ)上，再增加洗脫劑用量，解吸量有所增加，但增幅很小。因此，從節(jié)約成本出發(fā)，宜以1.5～2.0BV左右的洗脫劑用量進(jìn)行洗脫。

2.4 AB-8柱純化前后總黃酮純度的比較

經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附、解吸后，總黃酮純度由原來的5.80%變?yōu)?0.26%，產(chǎn)品精制倍數(shù)為5.2倍，即產(chǎn)品純度提高到5.2倍，說明AB-8樹脂能夠有效地對(duì)蘆蒿秸稈總黃酮進(jìn)行純化。

2.5 AB-8純化產(chǎn)物初步鑒定

2.5.1 顯色反應(yīng)

由表1可知，在鹽酸-鎂粉反應(yīng)過程中，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溶液由黃色逐漸變成紅色，說明蘆蒿秸稈含有黃酮類化合物。醋酸鎂與雙氫黃酮作用后，在紫外光條件下可呈現(xiàn)顯著的藍(lán)色熒光，而其他黃酮類化合物則呈黃色，結(jié)果(表1)表明，蘆蒿秸稈含有雙氫黃酮類化合物。黃酮化合物與鉛鹽反應(yīng)會(huì)生成黃色或紅色沉淀。沉淀色澤因羥基數(shù)目及位置不同而不同。其中，醋酸鉛只能與分子中具有鄰二酚羥基、3-羥基、4-酮基或5-羥基結(jié)構(gòu)的化合物作用，蘆蒿秸稈樣品與鉛鹽反應(yīng)有黃色沉淀生成，表明該提取物分子結(jié)構(gòu)中極有可能含有鄰二酚羥基(3-羥基、4-酮基或5-羥基)。與NaOH溶液作用后呈棕色，表明蘆蒿秸稈中含有黃酮醇類。

表 1 蘆蒿秸稈總黃酮的顯色反應(yīng)Table 1 Phenomena observed in the chromogenic reaction of total fl avonoids from

2.5.2 紫外吸收光譜分析

圖 7 樣品紫外-可見光譜圖Fig.7 UV-visible adsorption spectrum of the purifi ed product

黃酮類化合物由2個(gè)主要吸收帶組成，其中帶Ⅰ在300～400nm區(qū)間，由B環(huán)桂皮酰系統(tǒng)產(chǎn)生，帶Ⅱ在240～285nm區(qū)間，由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)產(chǎn)生。由圖7可知，樣品在229nm和328nm處有2個(gè)明顯的吸收峰，可能是由于甲基化和糖基化導(dǎo)致吸收帶向短波方向移動(dòng)，致使樣品紫外吸收帶Ⅱ向短波方向移動(dòng)，由于異黃酮、雙氫黃酮和雙氫黃酮醇的紫外光譜特征都具有強(qiáng)的帶Ⅱ吸收，而帶Ⅰ以帶Ⅱ的肩峰或低強(qiáng)度吸收峰出現(xiàn)，推斷蘆蒿秸稈黃酮中可能含有黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和雙氫黃酮類。樣品甲醇溶液加入試劑AlCl3后，帶Ⅰ的最大吸收波長為351nm，加入HCl后帶Ⅰ的最大吸收波長減小為331nm。加酸后移動(dòng)減小，指示鄰位雙OH存在，具體結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)上樣液pH值、上樣質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)及洗脫劑用量的確定等影響AB-8樹脂純化的因素進(jìn)行了研究，得出蘆蒿秸稈總黃酮純化的最佳工藝條件為吸附液pH4.0，上樣質(zhì)量濃度1.476mg/mL，上樣流速1mL/min，最大上柱體積為樹脂體積的2.5倍，洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為60%，洗脫流速1mL/min，最大洗脫體積為1.5～2.0BV左右。經(jīng)純化后，產(chǎn)品中總黃酮的純度由5.80%增加到30.26%，提高到5.2倍，由此可見，AB-8樹脂是蘆蒿秸稈總黃酮良好的純化劑，對(duì)蘆蒿秸稈總黃酮有較高的吸附和解吸性能，適用于總黃酮的純化研究。通過顯色反應(yīng)、紫外吸收特征光譜分析對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，得知蘆蒿秸稈黃酮中可能含有黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和雙氫黃酮類，并且結(jié)構(gòu)中有鄰位雙OH存在，具體結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步鑒定。

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