鮑志寧，林偉鋒*，葉 君，熊 犍*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

目前，乳酸菌發(fā)酵乳制品種類繁多，在各國社會經(jīng)濟和日常飲食中都起著重要作用[1-3]。高濃度發(fā)酵乳基料是一種新型的發(fā)酵乳制品，其蛋白質(zhì)含量為6%～10%，而普通發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)含量為2.9%～3.5%[4]。高濃度發(fā)酵乳基料具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸含量高和酸度高的特點，其作為一種創(chuàng)新型發(fā)酵乳基料將逐漸引起食品行業(yè)的關(guān)注。將發(fā)酵乳作為乳基料添加至其他食品中，如加至發(fā)酵乳飲料[5-6]和烘焙制品所用的香基[7-8]中也是發(fā)酵乳基的新型用途。

目前在奶味香基領(lǐng)域中，脂肪酶酶解乳脂制作香基已被廣泛應(yīng)用[9]。但酶法所得香基香型單調(diào)，易呈酸敗味，因此將微生物發(fā)酵與酶法結(jié)合是制備高品質(zhì)天然發(fā)酵乳香基料的重要途徑。現(xiàn)有研究中二者結(jié)合的研究主要為先發(fā)酵后酶解。于鐵妹等[10]將1.6%全脂乳經(jīng)德氏乳桿菌發(fā)酵后再加入脂肪酶酶解獲得天然奶味香基料。Tsai等[11]在乳酸菌發(fā)酵5h后，結(jié)合蛋白酶酶解來去除蛋白質(zhì)含量約為4%的發(fā)酵豆乳中的苦味并使其富含生物活性肽和γ-氨基丁酸(GABA)。而將乳酸菌發(fā)酵與酶解同步結(jié)合的研究很少，二者同步作用制備的高濃度發(fā)酵乳基料具有更為突出的發(fā)酵特征，將對發(fā)酵乳基料的研究和應(yīng)用具有積極意義。

本實驗通過高濃度發(fā)酵乳基料及與復(fù)合酶制劑酶解同步結(jié)合，來改善和提高其酸度和氨基酸態(tài)氮含量等特征，以期為高濃度發(fā)酵乳基料的應(yīng)用研究，提供新的實驗依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉(批號9121477) 雀巢公司；無水奶油(批號1233456) 新西蘭恒天然公司；干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，LC-L134-1-P) 本實驗室保存；復(fù)合酶(脂肪酶與蛋白酶符合，脂肪酶活力15000U/L，蛋白酶酶活力1.4AU/L) 廣州華琪生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25型pH計 上海精密科學儀器有限公司；SZX超凈工作臺 上海浦東躍新科學儀器廠；PYXDHS·400-BS恒溫培養(yǎng)箱 北京市醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 高濃度發(fā)酵乳基的制作

1.3.1.1 高濃度發(fā)酵乳基的配方

全脂奶粉30%(蛋白質(zhì)含量7.8%)、無水奶油5%、水70%、菌種干酪乳桿菌0.4‰。

1.3.1.2 高濃度發(fā)酵乳基的工藝

1.3.2 復(fù)合酶對高濃度發(fā)酵乳基的影響

1.3.2.1 復(fù)合酶的添加對高濃度發(fā)酵乳基的影響

在接種/加酶時，1#樣僅接種干酪乳桿菌發(fā)酵；2#樣為僅添加復(fù)合酶酶解；3#樣為干酪乳桿菌發(fā)酵與復(fù)合酶酶解相結(jié)合。對比3種條件下高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵/酶解過程產(chǎn)物的變化。

1.3.2.2 不同的復(fù)合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基的影響

在接種/加酶時，分別添加0.1‰(4#樣)、0.2‰(5#樣)、0.3‰復(fù)合酶(6#樣)與乳酸菌發(fā)酵相結(jié)合，對比不同復(fù)合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵過程的影響。

1.3.3 高濃度發(fā)酵乳基發(fā)酵過程中指標的測定

pH值的測定采用PHS-25型酸度計測定。酸度的測定采用°T表示發(fā)酵乳基的酸度[12]?；罹鷶?shù)的測定參見文獻[13]。氨基酸態(tài)氮含量的測定參見文獻[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵過程的發(fā)酵特性變化

圖 1 高濃度發(fā)酵乳基酸度隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Time course of pH and titratable acidity during fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值下降，下降速率由低到高再降低，發(fā)酵72h時pH值降至3.93。而普通發(fā)酵乳(蛋白質(zhì)含量3.0%，奶油含量0%)在發(fā)酵72h時pH值為3.6～3.7[14]。同時，隨著發(fā)酵時間的延長，高濃度發(fā)酵乳基料的滴定酸度上升，上升速率變化也與pH值下降速率變化相對應(yīng)，發(fā)酵72h時滴定酸度為268.5°T。普通的發(fā)酵乳發(fā)酵72h時滴定酸度僅為125～135°T。由于高濃發(fā)酵乳基料具有較高的蛋白質(zhì)含量和脂肪含量，對于干酪乳桿菌產(chǎn)生的乳酸有較強的緩沖作用，因此即使滴定酸度很高，pH值也僅為4.0左右。高濃發(fā)酵乳基料的滴定酸度是普通發(fā)酵乳的2倍，若應(yīng)用于發(fā)酵乳飲料調(diào)配，添加量僅需20%～30%即可達到適宜的酸度。

圖 2 高濃度發(fā)酵乳基活菌數(shù)和氨基酸態(tài)氮隨發(fā)酵時間的變化Fig.2 Time course of the viable cell number of Lactobacillus casei and amino nitrogen content during fermentation

由圖2可知，干酪乳桿菌在發(fā)酵28h時由對數(shù)期進入穩(wěn)定期，與圖1中產(chǎn)酸速率變化拐點一致。同時，在發(fā)酵28～72h過程中，活菌數(shù)穩(wěn)定在1×109CFU/mL，這一方面是因為高濃度發(fā)酵乳基中含有大量的碳源和氮源，另一方面說明該干酪乳桿菌具有對較高酸度具有耐受性的特征[15]。圖2中氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵過程中的變化呈現(xiàn)緩慢波動上升的趨勢。乳酸菌在增殖過程中，不斷地分泌蛋白酶水解乳蛋白產(chǎn)生游離氨基酸，產(chǎn)生的游離氨基酸不僅用于滿足干酪乳桿菌對氮源的需要，而且可以作為發(fā)酵風味物質(zhì)[16]。發(fā)酵72h后，高濃度發(fā)酵乳基中的氨基酸態(tài)氮含量由初始的0.097g/100g增加至0.117g/100g，提高了20.6%。而同樣菌株發(fā)酵72h，普通發(fā)酵酸奶的氨基酸態(tài)氮含量僅為0.061g/100g。

2.2 復(fù)合酶對高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵的影響

圖 3 復(fù)合酶對高濃度發(fā)酵乳基酸度的影響Fig.3 Time course of pH and titratable acidity during simultaneous hydrilysis and fermentation

由圖3可知，僅添加復(fù)合酶的高濃度發(fā)酵乳基料(2#樣)pH值下降幅度比添加了干酪乳桿菌的高濃度發(fā)酵乳基料(1#樣和3#樣)小，發(fā)酵72 h時，2#樣pH值為5.21，而1#樣和3#樣pH值均為3.90，且二者在發(fā)酵過程中pH值變化趨勢基本一致。同時乳酸菌與復(fù)合酶相結(jié)合的高濃度發(fā)酵乳基料(3#樣)的滴定酸度遠高于1#樣和2#樣，近于2#樣滴定酸度的兩倍。發(fā)酵72 h時，3#樣滴定酸度為414.4°T， 2#樣僅為241.1°T。這是由于復(fù)合酶中的脂肪酶會將乳脂分解成脂肪酸，脂肪酸的羧基使乳基料具有較高的滴定酸度和pH值。3#樣中由于復(fù)合酶中的蛋白酶酶解乳蛋白，為乳酸菌提供了更多氨基酸作為速效氮源，促進了菌株的增殖和乳酸分泌，進而與脂肪酸協(xié)同獲得更高的滴定酸度。

圖 4 復(fù)合酶對高濃度發(fā)酵乳基活菌數(shù)和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Time course of the viable cell number of Lactobacillus casei and amino nitrogen content during simultaneous hydrilysis and fermentation

2#樣品在發(fā)酵過程中無菌落檢出。由圖4可知，3#樣中干酪乳桿菌于20h時從對數(shù)期進入穩(wěn)定期，1#樣則于28h轉(zhuǎn)折。同時在發(fā)酵50h之前，1#樣的活菌數(shù)均比3#樣高。這是因為乳酸菌內(nèi)生性酶構(gòu)成簡單，許多氨基酸不能由自身合成，因此乳酸菌培養(yǎng)時往往需要含有豐富氨基酸的物質(zhì)來提供氮源[17-18]。蛋白酶分解的氨基酸作為速效氮源促進菌株生長繁殖，但氮源過多則會使菌體生長過于旺盛，反而加速菌體的衰老和自溶[19-20]，菌株分裂與衰退均加速，因此活菌數(shù)沒有明顯增加。隨著酶解脂肪酸的積累使滴定酸度大幅升高，也在一定程度上抑制了干酪乳桿菌的生長。因此3#樣在發(fā)酵20～72h活菌數(shù)保持平穩(wěn)。2#樣和3#樣的氨基酸態(tài)氮含量隨著酶解和發(fā)酵時間的延長不斷增加，并且比1#樣有大幅提高。在72h處，氨基酸態(tài)氮含量1#樣為0.117g/100g，2#樣為0.131g/100g，3#樣為0.132g/100g，3#樣比1#樣提高12.8%。

因此，乳酸菌發(fā)酵劑與酶制劑復(fù)配將發(fā)酵和酶解同步進行獲得的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量，使其作為一種發(fā)酵乳基料的特征更為突出，更有利于其在各類食品中的應(yīng)用。

2.3 不同復(fù)合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基料發(fā)酵的影響

圖 5 不同復(fù)合酶添加量對高濃度發(fā)酵乳基酸度的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on pH and titratable acidity

由圖5可知，3種不同濃度的復(fù)合酶添加量(4#樣0.1‰，5#樣0.2‰，6#樣0.3‰)的高濃度發(fā)酵乳基料pH值變化趨勢和數(shù)值是完全一致的，最終pH值在3.92～3.98之間。而滴定酸度則受復(fù)合酶添加量的影響明顯，復(fù)合酶添加量高的高濃度發(fā)酵乳基料滴定酸度也相應(yīng)較高，由高到低依次為409.2、361.2、350.1°T，同時3個樣品的滴定酸度變化趨勢是基本一致。因此可以選擇不同的復(fù)合酶添加量和發(fā)酵時間來滿足不同的產(chǎn)品需求。

由圖6可知，3個樣品在活菌數(shù)變化趨勢和數(shù)值上是完全一致的，這可能是因為復(fù)合酶中蛋白酶酶解乳蛋白產(chǎn)生氨基酸的量遠遠超過干酪乳桿菌增殖需要，以及當酸度超過某個值其對干酪乳桿菌的抑制程度也趨向一致。高濃度發(fā)酵乳基料的氨基酸態(tài)氮含量隨著復(fù)合酶添加量的增加在發(fā)酵后期(46h之后)有不同程度的提高，4#樣為0.125g/100g，6#樣為0.134g/100g。3個樣品氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢也與滴定酸度保持一致。

3 結(jié) 論

本實驗研究了蛋白質(zhì)含量為7.8%的高濃度發(fā)酵乳基料在發(fā)酵過程中的動力學參數(shù)變化情況，獲得的高濃度發(fā)酵乳基料的滴定酸度和氨基酸態(tài)氮含量均較高，同時高濃度緩沖體系使pH值也較高，干酪乳桿菌LC-L134-1-P對酸的良好耐受性使其活菌數(shù)穩(wěn)定在1×109CFU/mL左右。本實驗進一步將復(fù)合酶制劑與乳酸菌發(fā)酵劑復(fù)配獲得的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量。同時復(fù)合酶含量越高，高濃度發(fā)酵乳基料的酸度和氨基酸態(tài)氮含量越高。綜合看來，經(jīng)過發(fā)酵和酶解的高濃度發(fā)酵乳基料具有更高的酸度和氨基酸態(tài)氮含量的特征，接下來將對其在發(fā)酵過程中酶與發(fā)酵劑同步作用機理，以及高濃度發(fā)酵乳基料在風味、在焙烤等食品中的增香應(yīng)用和功能性做更深入研究。

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