重組畢赤酵母葡萄糖氧化酶的純化和性質(zhì)

郝杰清，王帥坤，師 慧，王振偉，孟延發(fā)*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD，EC 1.1.3.4)是一種需氧脫氫酶，能夠在有氧條件下高度專(zhuān)一性的將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫[1]。它廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。葡萄糖氧化酶在食品工業(yè)、醫(yī)療診斷、生物傳感器方面有著廣泛的應(yīng)用[2-4]。目前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的主要是青霉屬和黑曲霉兩種[5-6]。但這兩種菌在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的雜蛋白，較難純化。甲醇畢赤酵母是一類(lèi)新的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有真核表達(dá)系統(tǒng)所共有的優(yōu)點(diǎn)，而且表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外，雜蛋白少，易于純化[7-8]。本研究在已有重組畢赤酵母葡萄糖氧化酶基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行分離純化并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為其在食品工業(yè)和醫(yī)藥生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

重組Pichia pastoris GS115是用黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因構(gòu)建的基因工程酵母菌，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20、酵母膏10、葡萄糖20，自然pH值。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20、酵母膏10，溶于100mmol/L pH6.0的磷酸鉀緩沖液中。均于121℃滅菌30min。

1.1.2 試劑與儀器

酵母膏、蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司；過(guò)氧化物酶(POD) 日本Toyobo公司；牛血清白蛋白(BSA)、4-嗎啉乙磺酸(MES) 美國(guó)Sigma公司；4-氨基安替比林(4-AA) 上海靈錦精細(xì)化工有限公司；EHSPT 上海阿拉丁試劑有限公司；Q-Sepharose Fast Flow 美國(guó)Pharmacia公司；葡萄糖、無(wú)水甲醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。

5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UV-2102紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；Mini Ⅱ型電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Pellicon Biomax超濾器 美國(guó)Millipore公司；HD-2000紫外檢測(cè)儀 上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

將在斜面培養(yǎng)基上(30℃)培養(yǎng)48h的畢赤酵母接入種子培養(yǎng)基中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h至OD600nm約為2～6，種子液以5%的接種量接入300mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件振蕩培養(yǎng)24h，以體積分?jǐn)?shù)0.5%加入甲醇開(kāi)始誘導(dǎo)，溫度調(diào)整為25℃，每24h后加入等量的甲醇連續(xù)誘導(dǎo)10d。將發(fā)酵液在4℃、10000r/min離心5min，收集上清液，即為粗酶液。

1.2.2 酶的分離純化

將粗酶液在冰浴條件下用Biomax 50kD超濾器濃縮至較小體積，用pH7.0 20mmol/L磷酸鉀緩沖液透析除鹽，上Q-Sepharose Fast Flow柱，以0～0.5mol/L NaCl，pH7.0 20mmol/L磷酸鉀緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫，檢測(cè)并收集有酶活性部分。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford法[9]，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 重組葡萄糖氧化酶酶活力的測(cè)定

取適當(dāng)稀釋后酶液50μL，加入1.0mL 含有79mmol/L pH6.0 MES-Na，131mmol/L葡萄糖，0.2mmol/L 4-AA，0.3mmol/L EHSPT，4U/mL POD的底物反應(yīng)液中，在40℃準(zhǔn)確反應(yīng)5min，再置于沸水浴中快速滅活30s，冷卻至室溫，在波長(zhǎng)555nm處測(cè)定其吸光度；空白對(duì)照除酶液預(yù)先滅活，其他處理相同。在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol/L H2O2所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.2.5 分子質(zhì)量的測(cè)定

梯度PAGE[10]測(cè)定GOD全蛋白分子質(zhì)量，濃縮膠4.0%、分離膠5.0%～15.0%；SDS-PAGE[10]測(cè)定GOD亞基分子質(zhì)量，濃縮膠4.0%、分離膠10.0%，在還原和非還原條件下進(jìn)行電泳；考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.6 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的分析

在40℃條件下測(cè)定GOD純酶在pH 3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0時(shí)的酶活性，確定GOD的最適pH值。將酶液用0.2mol/L的不同pH值(3.0～12.0)的緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?℃處理24h后在40℃、pH6.0條件下測(cè)定剩余酶活力，考察酶的酸堿穩(wěn)定性。

pH3.0～6.0為0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；pH7.0～9.0為0.2mol/L Tris-HCl緩沖液；pH10.0～12.0為0.2mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

1.2.7 最適溫度和熱穩(wěn)定性的分析

在pH6.0條件下測(cè)定25～60℃的酶活力，確定酶的最適溫度。將適當(dāng)稀釋的酶液在不同溫度(40、45、50、55、60℃)條件下分別處理10、20、30、40min后，在40℃、pH6.0條件下測(cè)定剩余酶活力，觀察酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8 部分金屬離子和試劑對(duì)GOD活性的影響

在反應(yīng)體系中分別加入濃度均為2.0mmol/L的金屬離子(Mg2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+、Ag+、Zn2+、Cu2+、Al3+)和試劑(5.0mmol/L的EDTA、NaN3、2.0mmol/L NaF以及0.2%的SDS、Triton X-100、吐溫-20)，測(cè)定酶活力，以未加入化學(xué)試劑的酶液做對(duì)照，觀察金屬離子和試劑對(duì)酶活力的影響。

1.2.9 米氏常數(shù)(Km)的測(cè)定

在40℃、pH6.0條件下，變化葡萄糖濃度(6～120mmol/L)，測(cè)定GOD酶活力。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定GOD對(duì)底物葡萄糖的Km。

1.2.10 GOD的光譜特征

在UV-2102紫外分光光度計(jì)上對(duì)GOD進(jìn)行自然條件下的紫外光譜測(cè)定，掃描波長(zhǎng)200～340nm。用蒸餾水做對(duì)照調(diào)節(jié)基線。

在F-4500熒光分光光度計(jì)上對(duì)GOD進(jìn)行自然條件下的內(nèi)源熒光光譜測(cè)定，以280nm為激發(fā)波長(zhǎng)。其中，光徑1cm，激發(fā)與發(fā)射光夾縫為5nm，光電倍增管的電壓為700V，掃描速率1200nm/min。

1.2.11 GOD的液體保存穩(wěn)定性

將過(guò)濾除菌后的液體GOD純酶分別放置在4、25℃和37℃條件下，每隔一段時(shí)間測(cè)定剩余酶活性，考察GOD的保存穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

取3 0 0 m L 發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心，濃縮，透析除鹽后為20mL，上Q-Sepharose Fast Flow層析柱(3cm×4cm)，洗脫曲線見(jiàn)圖1，蛋白含量和酶活性最高的部分均為50～150mL。純化前后電泳圖譜見(jiàn)圖2，純化后得到單一蛋白條帶，酶比活力由54.08U/mg提高到73.17U/mg，純化1.35倍，收率達(dá)92.7%(表1)。純化的葡萄糖氧化酶經(jīng)SDS-PAGE(還原/非還原條件下)鑒定，由標(biāo)準(zhǔn)蛋白可知該酶分子肽鏈的分子質(zhì)量約為75kD(圖3)。通過(guò)梯度PAGE測(cè)得GOD全酶分子質(zhì)量約為150kD(圖4)。

pH值對(duì)GOD酶活性的影響結(jié)果(圖5)表明，該酶在pH6.0時(shí)活性最大；在pH5.0～8.0之間較穩(wěn)定，催化活力無(wú)明顯變化，而酶在pH4.0以下或pH9.0以上，其穩(wěn)定性迅速下降。溫度對(duì)酶活性的影響結(jié)果(圖6)表明，該酶的最適溫度為40℃，在30～50℃之間有較高的酶活力，60℃及以上活力較低；將酶液在50℃以下作用20min，活性基本不變，高于55℃后酶穩(wěn)定性降低，在60℃保溫40min，酶基本失活。

表 1 重組葡萄糖氧化酶的純化結(jié)果Table 1 Summary of isolation and purification of recombinant P.pastoris GOD

圖 1 離子交換層析圖Fig.1 Elution profi le of GOD on Q-Sepharose Fast Flow column

圖 2 純化前后葡萄糖氧化酶的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE of crude and purifi ed GOD

圖 3 純化后GOD的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE pattern for molecular weight determination of purifi ed GOD

圖 4 純化后GOD的梯度PAGEFig.4 Gradient PAGE of purifi ed GOD

2.2 pH值和溫度對(duì)GOD酶活力的影響

圖 5 葡萄糖氧化酶的最適pH值(A)和酸堿穩(wěn)定性(B)Fig.5 Optimum pH (A) and pH stability (B) of GOD

圖 6 葡萄糖氧化酶的最適溫度(A)和溫度穩(wěn)定性(B)Fig.6 Optimum temperature and temperature stability of GOD

pH值對(duì)酶活性的影響結(jié)果(圖5)表明，該酶在pH6.0時(shí)活性最大；在pH5.0～8.0之間較穩(wěn)定，催化活力無(wú)明顯變化，而酶在pH4以下或pH9以上，其穩(wěn)定性迅速下降。溫度對(duì)酶活性的影響結(jié)果(圖6)表明，該酶的最適溫度為40℃，在30～50℃之間有較高的酶活力，60℃及以上活力較低；將酶液在50℃以下作用20min，活性基本不變，高于55℃后酶穩(wěn)定性降低，在60℃保溫40min，酶基本失活。

2.3 部分金屬離子、表面活性劑和有機(jī)溶劑對(duì)GOD活性的影響

表 2 不同化學(xué)試劑對(duì)重組GOD活性的影響Table 2 Effects of different chemicals on GOD activity

由表2可知，Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+對(duì)葡萄糖氧化酶有強(qiáng)烈的抑制作用，2.0mmol/L Ag+、Cu2+、Fe2+均可使酶活力完全喪失，其他金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶的活力影響不大。表面活性劑SDS對(duì)GOD有抑制作用，0.2% SDS作用后酶活力剩余77%。

2.4 米氏常數(shù)的測(cè)定結(jié)果

以6～120mmol/L葡萄糖為底物，在pH6.0、40℃條件下，測(cè)定底物反應(yīng)速率，按Lineweaver-Burk法作圖(圖7)，求出葡萄糖氧化酶的Km為21.06mmol/L。

圖 7 葡萄糖氧化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plot of GOD

2.5 GOD的光譜特征

圖8是GOD溶液在200～340nm波長(zhǎng)范圍掃描得到的GOD紫外吸收光譜曲線，結(jié)果顯示GOD在波長(zhǎng)275nm處有最大光吸收。圖9是在280nm波長(zhǎng)激發(fā)下得到的GOD熒光發(fā)射光譜，最大峰位于344nm處。

圖 8 自然狀態(tài)下GOD的紫外光譜圖Fig.8 Ultraviolet absorption of GOD

圖 9 GOD的內(nèi)源熒光光譜(280nm激發(fā))Fig.9 Fluorescence absorption of GOD

2.6 GOD的液體保存穩(wěn)定性結(jié)果

圖 10 葡萄糖氧化酶的液體保存穩(wěn)定性Fig.10 Storage ability of GOD in water

將純化后的液體葡萄糖氧化酶樣品除菌后分別在4、25、37℃條件下放置一段時(shí)間后，在最適條件下測(cè)定其酶活力。由圖10可知，在4℃條件下放置6個(gè)月活性沒(méi)有損失。常溫25℃放置10d酶活力仍有76%，放置20d后仍有酶活力約56%；37℃條件下酶活力下降較為明顯，1d后約有酶活力70%，10d后酶活力有20%?？傮w來(lái)說(shuō)，在液體狀態(tài)下，葡萄糖氧化酶在冷藏下是穩(wěn)定的，常溫下可放置3～5d。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從甲醇畢赤酵母發(fā)酵的上清液中得到的葡萄糖氧化酶，雜蛋白含量低，且不需破碎菌體，只經(jīng)過(guò)一步離子交換層析就可以達(dá)到電泳純，純化收率高達(dá)92.7%，張茜等[11]從青霉中提取的GOD和蘇茉等[12]從黑曲霉中提取的GOD都需要經(jīng)過(guò)DEAE離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析兩步才能純化，時(shí)間和費(fèi)用成本相對(duì)較高，蘇茉等[12]純化的收率也僅為30.2%。另外本實(shí)驗(yàn)省去了上樣量小，耗時(shí)長(zhǎng)的凝膠過(guò)濾層析，有利于大規(guī)模純化。有關(guān)文獻(xiàn)[11,13-14]報(bào)道葡萄糖氧化酶是分子質(zhì)量在150～170kD之間的二聚體，本實(shí)驗(yàn)純化得到的酶分子質(zhì)量為150kD，亞基分子質(zhì)量為75kD，與報(bào)道相符。

本實(shí)驗(yàn)得到的GOD純品的最適pH值為6.0，在pH5.0～8.0之間都可以穩(wěn)定存在，由此可見(jiàn)該酶的pH值穩(wěn)定范圍較寬，酸堿耐受性很強(qiáng)，適于工業(yè)生產(chǎn)。提純的葡萄糖氧化酶的最適溫度為40℃，在50℃條件下保溫30min仍有90%酶活力，可見(jiàn)該酶的熱穩(wěn)定性良好，在食品工業(yè)中可以適用不同的滅菌條件，溫度高對(duì)防止雜菌的生長(zhǎng)也很有利，因此提純的GOD有很高的應(yīng)用價(jià)值。

不同來(lái)源的GOD的Km值不同，周亞鳳等[15]報(bào)道的黑曲霉葡萄糖氧化酶的Km值為38.25mmol/L，張茜等[11]純化的青霉菌葡萄糖氧化酶Km值為122.6mmol/L，Rando等[16]報(bào)道的GOD的Km值為6.2mmol/L，王志新等[17]測(cè)得的黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的Km為35.74mmol/L。Km值表征酶與底物親和力的大小，Km越小，親和力越大，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的GOD的Km值為21.06mmol/L，顯示本實(shí)驗(yàn)得到的GOD對(duì)葡萄糖的親和力較好。

在蛋白質(zhì)中Trp、Tyr、Phe等殘基可以吸收紫外光[18]，因此蛋白質(zhì)溶液對(duì)一定波長(zhǎng)范圍的紫外光具有吸收值，葡萄糖氧化酶在275nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，符合其特征吸收峰。在蛋白質(zhì)分子中，能夠發(fā)射熒光的氨基酸為Phe、Tyr和Trp，以280nm為激發(fā)波長(zhǎng)得到的熒光發(fā)射光譜是由Trp和Tyr等殘基共同生成[19-20]，并沒(méi)有出現(xiàn)由Tyr基團(tuán)產(chǎn)生的熒光峰(303nm)，因此說(shuō)明天然GOD的內(nèi)源熒光來(lái)自Trp基團(tuán)，在GOD分子內(nèi)可能由于Tyr與Trp距離很近而產(chǎn)生了從Tyr與Trp的能量轉(zhuǎn)移，與其游離Trp基團(tuán)的最大熒光發(fā)射峰348nm相比，藍(lán)移至344nm，藍(lán)移了4nm。蛋白質(zhì)分子中Trp如果位于蛋白質(zhì)分子表面，其最大熒光發(fā)射峰應(yīng)當(dāng)在342～350nm之間，如果Trp位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，最大熒光發(fā)射峰應(yīng)當(dāng)在326～342nm之間，如果Trp位于非極性環(huán)境中，最大熒光發(fā)射峰應(yīng)當(dāng)在310～324nm之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在GOD分子內(nèi)Trp基團(tuán)可能位于分子表面。

該酶被Hg2+、Ag+、Cu2+、Fe2+強(qiáng)烈抑制，Mg2+、Ca2+、Mn2+等對(duì)酶活性幾乎沒(méi)有影響，由此可見(jiàn)葡萄糖氧化酶在測(cè)定含有上述離子的樣品時(shí)不會(huì)有明顯影響，所以此酶可廣泛應(yīng)用于血糖含量的測(cè)定。液體狀態(tài)下該酶可長(zhǎng)期冷凍保存，在常溫下也可保存3～5d，有利于該酶在生物傳感器方面的應(yīng)用。綜上所述，葡萄糖氧化酶具有很大的應(yīng)用潛力，適用于食品、醫(yī)療、生物等行業(yè)。但是液體葡萄糖氧化酶在37℃條件下的保存時(shí)間較短，將該酶固定化來(lái)提高其穩(wěn)定性方面還可做進(jìn)一步的研究。

[1] BANKAR S B, BULE M V, SINGHAL R S. Glucose oxidase： an overview[J]. Biotechnology Advances, 2009, 27(4)： 489-501.

[2] WONG C M, WONG K H, CHEN Xiaodong. Glucose oxidase： natural occurrence, function, properties and industrial applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(6)： 927-938.

[3] MINKSTIMIENE A K, MAZEIKO V, RAMANAVICIENE A. Evaluation of amperometric glucose biosensors based on glucose oxidase encapsulated within enzymatically synthesized polyaniline and polypyrrole[J]. Sensors and Actuators B, 2011, 158(1)： 278-285.

[4] CRUZ A G, CASTRO W F, FARIA J A F. Glucose oxidase： a potential option to decrease the oxidative stress in stirred probiotic yogurt[J]. Food Science and Technology, 2012, 47(2)： 512-515.

[5] HATZINIKOLAOU D G, HANSEN O C, MACRIS B J, et al. A new glucose oxidase from Aspergillus niger： characterization and regulation studies of enzyme and gene[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1996, 46(4)： 371-381.

[6] SUKHACHEVA M V, DAVYDOVA M E, NETRUSOV A I. Production of Penicillium funiculosum 433 glucose oxidase and its properties[J]. Appl Biochem Microbiol, 2004, 40(1)： 25-29.

[7] YAMAGUCHI M, TAHARA Y, NAKANO A, et al. Secretory and continuous expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in Pichia pastoris[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2007, 55(2)： 273-278.

[8] CROGNALE S, PULCI V, BROZZOLI V, et al. Expression of Penicillium variabile P16 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(6)： 1230-1235.

[9] 李娟, 張耀庭. 應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2000, 13(2)： 118-120.

[10] 郭曉君. 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京： 科學(xué)出版社, 2001： 128-140.

[11] 張茜, 傅婉輝, 康勁翮, 等. 青霉葡萄糖氧化酶的分離純化及性質(zhì)研究[J]. 廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版, 2009, 48(1)： 99-102.

[12] 蘇茉, 高亞鵬, 梁建榮, 等. 黑曲霉H1-9b葡萄糖氧化酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(3)： 181-186.

[13] 張婷. Aspergillius niger Z-25產(chǎn)葡萄糖氧化酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[14] SIMPSON C, JORDAAN J, GARDINER N S, et al. Isolation, purification and characterization of a novel glucose oxidase from Penicillium sp.CBS 120262 optimally active at neutral pH[J]. Protein Expression and Purifi cation, 2007, 51(2)： 260-266.

[15] 周亞鳳, 張先恩, 劉虹, 等. 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表達(dá)[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(4)： 400-405.

[16] RANDO D, KOHRING G W, GIFFHORN F. Production, purifi cation and characterization of glucose oxidase from a newly isolated strain of Penicillium pinophilum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1997, 48(1)： 34-40.

[17] 王志新, 于宏偉, 韓軍, 等. 黑曲霉A9葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(4)： 69-74.

[18] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長(zhǎng)法. 生物化學(xué)[M]. 3版. 北京： 高等教育出版社, 2002： 145-146.

[19] PRZYBYT M, MILLER E, SZREDER T. Thermostability of glucose oxidase in silica gel obtained by sol-gel method and in solution studied by fl uorimetric method[J]. J Photoch Photobio B, 2011, 103(1)： 22-28.

[20] 袁燕, 肖涵, 康洪鈞, 等. 新的植物毒素蒜頭果蛋白的熒光光譜研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 29(3)： 777-780.