欒光輝，劉春鳳，李崎

1(江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122)

生物胺是一種含氮的低分子量有機(jī)化合物，其主要來源為生物體細(xì)胞代謝過程中由氨基酸在脫羧酶的作用下脫羧［1-2］。其中的組胺和酪胺作為一類有毒物質(zhì)在攝入過量時(shí)有一定危害。對于高血壓患者四小時(shí)內(nèi)攝入6 mg 酪胺或者啤酒中酪胺含量大于10 mg/L，都被認(rèn)為是危險(xiǎn)的;組胺能夠引起人的過敏或過敏類反應(yīng)［3］。文獻(xiàn)［4］中提到，口服8 ～40 mg 組胺便會(huì)有輕微的反應(yīng)，超過100 mg 產(chǎn)生嚴(yán)重的中毒反應(yīng);美國食品藥品管理局(FDA)對于魚類中組胺的含量限制為50 mg/kg，將500 mg/kg 定為危險(xiǎn)水平?？诜野烦^100 mg 可能會(huì)引起偏頭痛。有報(bào)道稱生物胺大量存在于葡萄酒［5］、奶酪［6］、海產(chǎn)品［7］、啤酒［8］和其他發(fā)酵產(chǎn)品［9-11］中，在肉類、水產(chǎn)品及其制品中，生物胺是衡量其新鮮程度及保藏狀況的重要指標(biāo)［12］，高含量的生物胺在任何食品中都意味著腐敗微生物的污染，但除了少數(shù)國家對食品中個(gè)別種類生物胺(例如組胺)有含量上限規(guī)定外，包括中國在內(nèi)的大部分國家并沒有限制或指導(dǎo)性的標(biāo)準(zhǔn)。

生物胺通常使用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，因?yàn)槠渚哂休^好的靈敏度、分離度和較為簡單的樣品處理過程［13］。但是由于生物胺在可見和紫外光區(qū)域沒有熒光和令人滿意的吸收，進(jìn)行檢測時(shí)通常會(huì)先對其進(jìn)行衍生化處理，常用的衍生試劑有苯磺酰氯(Dbs-Cl)、丹磺酰氯(Dns-Cl)、鄰苯二甲醛(oPA)、苯甲酰氯(BZ-Cl)等［14-17］?？紤]到衍生和分析時(shí)間以及產(chǎn)物的穩(wěn)定性，本研究選用苯甲酰氯作為衍生試劑，選用紫外檢測器254 nm 檢測波長，梯度洗脫，流動(dòng)相采用乙腈和乙酸銨水溶液。

美國［18］、巴西［8］、歐洲［19］對其啤酒中的生物胺均有報(bào)道，中國啤酒相關(guān)報(bào)道不多，Tao Tang 對國內(nèi)的18 種啤酒中7 種生物胺含量進(jìn)行過檢測［13］，使用的是一種全新的衍生試劑，對市售啤酒生物胺含量做了調(diào)查性的檢測。陳宏靖在2011 年對50 種市售啤酒進(jìn)行了8 種生物胺含量水平的檢測［20］，與Tao Tang 一樣也并未針對啤酒進(jìn)行進(jìn)一步的探討。本文選取了腐胺(PUT)、尸胺(CAD)、亞精胺(SPD)、精胺(SPM)、色胺(TRY)、β-苯乙胺(PHE)、組胺(HIS)、酪胺(TYR)8 種常見生物胺［3，21］，對市售啤酒生物胺含量進(jìn)行檢測，了解啤酒整體生物胺水平;就不同廠家間的啤酒進(jìn)行了比較，分析了原麥汁濃度、酒精度數(shù)與生物胺含量的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)品與試劑

標(biāo)品:組胺二鹽酸鹽購自BIO BASIC INC，色胺、β-苯乙胺購自Adamas Reagent，腐胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、精胺、亞精胺、尸胺二鹽酸鹽購自Sigma-Aldrich，所有標(biāo)品的純度均≥98%。試劑:色譜純乙腈購自Sigma-Aldrich，超純水由Milli-Q 純化水系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室自制，苯甲酰氯購自Adamas Reagent。其他藥品均為分析純，購自Sinopharm Chemical Reagent Co. ，Ltd。生物胺標(biāo)品制成1 g/L 水溶液作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋至所需濃度，混標(biāo)由儲(chǔ)備液混合得到。儲(chǔ)備液4℃避光保存。啤酒樣品購自附近城市超市。

1.2 衍生反應(yīng)

衍生過程參考Hwang 等人［22］的方法，稍作修改。具體方法為10 mL 離心管中加入2 mL 除氣后待測樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品溶液，之后加入1 mL NaOH 溶液(濃度為2 mol/L)，搖勻后加入20 μL 苯甲酰氯，所得溶液于30 攝氏度200 r/min 振蕩20 min 后加入2 mL 飽和NaCl 溶液，混勻后加入3 mL 乙醚進(jìn)行萃取，室溫下200 r/min 振蕩5 min 后3 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至5 mL 試管中氮?dú)獯蹈?。吹干后試管殘留物? mL 色譜純乙腈溶解后過0.45 μm 尼龍膜后用于高效液相色譜分離檢測。

1.3 色譜方法

Waters1525 二元泵配備柱溫箱，Waters 2487 雙波長紫外檢測器，Waters717plus 自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(particle size 5 μm，250 mm×4.6 mm i. d. )，使用Breeze 工作站進(jìn)行液相數(shù)據(jù)的獲得。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析使用軟件為SPSS17.0 與MATBAB7.1。液相洗脫梯度如表1 所示，柱溫28℃，流速0.6 mL/min，檢測器波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證

優(yōu)化后檢測方法的驗(yàn)證結(jié)果見表2?？梢钥闯?，8 種生物胺的含量在0.1 ～40 mg/L 時(shí)，其回歸方程R2大于等于0.991 5，其檢測限(LOD)最低者為酪胺0.005 mg/L，最高者為色胺0.029 mg/L，本文使用LOD 的3 倍含量作為定量限，含量大于檢出限但低于定量限者不定量。對同一樣品進(jìn)樣7 次，所得精密度(RSD)小于1.96%，回收率在86.0% ～112.5%。

驗(yàn)證結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取及色譜條件可以滿足生物胺檢測的需求。

表2 優(yōu)化后檢測方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限、精密度及回收率Table 2 Linear range，regression equation，R2，LOD，RSD and recovery of the detection method in optimum conditions

2.2 市售啤酒生物胺含量檢測

使用已優(yōu)化好的方法對29 種市售啤酒進(jìn)行了生物胺含量的檢測，結(jié)果如表3 所示。從表3 中可以看出，尸胺在所檢測的啤酒中含量很少，均低于定量限;除26 和29 號(hào)樣品外，其余樣品亞精胺含量均低于定量限;腐胺、色胺和酪胺在所有啤酒中均能檢出;精胺、苯乙胺和組胺3 種生物胺根據(jù)樣品的不同其檢出與定量情況也不同。其中，腐胺含量在0.03 ～3.37 mg/L，亞精胺含量在0 ～0.44 mg/L，精胺含量在0 ～2.74 mg/L，色胺含量在0 ～1.49 mg/L，苯乙胺含量0～1.19 mg/L，組胺含量在0 ～3.63 mg/L，酪胺含量在1.09 ～4.96 mg/L，8 種生物胺總量在4.21 ～10.59 mg/L。結(jié)果表明，啤酒中無論對人體危害較大的組胺、酪胺還是生物胺總量均不能對消費(fèi)者健康達(dá)到危害水平。這跟啤酒生產(chǎn)大都采用酵母的單一菌種發(fā)酵，且釀造過程自動(dòng)化程度高，微生物控制嚴(yán)格有密切關(guān)系。

1 -13、14 -17、18 -19、20 -21、22 -23、24 -25、26 -28、29 號(hào)樣品分別為8 個(gè)不同啤酒公司產(chǎn)品，比較定量限以上的生物胺種類，不同公司存在差異，14-17 號(hào)樣品均不能檢出苯乙胺，18 -19、20 -21、22-23、24 -25 號(hào)四家公司的產(chǎn)品精胺含量比較低;但相似性也很明顯，大部分啤酒中尸胺和亞精胺含量都比較低，也并沒有生物胺總量上出現(xiàn)異常的產(chǎn)品。

表3 市售啤酒生物胺含量Table 3 Content of biogenic amines in commercially available beer

2.3 啤酒原麥汁濃度、酒精度與生物胺含量的關(guān)系

為進(jìn)一步了解不同原麥汁濃度的啤酒對與生物胺含量的關(guān)系。比較相同廠家相近時(shí)間出廠的不同原麥汁濃度的啤酒中的生物胺，例如從5 ～9.5°P 四個(gè)濃度梯度的14 -17 號(hào)樣品?？梢钥闯觯?苯乙胺在4 種啤酒中均未檢出，尸胺和亞精胺雖然有個(gè)別檢出也都不能定量。無論是單種生物胺還是總體含量，4 種啤酒都不是隨著原麥汁濃度的升高而使生物胺含量提高，腐胺和酪胺含量最低的樣品是原麥汁濃度最高的啤酒，且精胺和生物胺總量也并非最高;相反，原麥汁濃度7°P 的啤酒中精胺、酪胺生物胺總量含量最高;8°P 原麥汁濃度的啤酒腐胺含量最高，但精胺和色胺含量卻是最低的。通常情況下相同廠家啤酒的發(fā)酵液濃度相近，成品啤酒原麥汁濃度通常是在濾酒時(shí)加入脫氧水稀釋決定，而生物胺既然在啤酒中就應(yīng)該受稀釋程度的影響;即使發(fā)酵液濃度不同，最終換算成相同的原麥汁濃度即為相似的原料含量，生物胺含量也應(yīng)該相近，但事實(shí)并非如此。

造成這種現(xiàn)象的原因可能是，雖然啤酒后稀釋之后原麥汁濃度低的稀釋強(qiáng)度大，各種物質(zhì)包括生物胺的濃度應(yīng)該相應(yīng)降低，但這是對于同一罐酒而言。實(shí)際情況往往是不同原麥汁濃度的啤酒并非由一個(gè)大罐發(fā)酵得來，即來源不同。由啤酒發(fā)酵液本身生物胺含量不同所造成的影響可能遠(yuǎn)大于后稀釋過程中濃度的變化造成的影響，因此造成了這種原麥汁濃度和生物胺含量沒有關(guān)系的現(xiàn)象。

啤酒的酒精度由原麥汁濃度和麥汁的發(fā)酵度共同決定，為了口味的清爽干凈，目前啤酒的發(fā)酵度一般都較高(65% ～70%左右甚至更高)，因此使得相同的原麥汁濃度有相似的酒精含量。關(guān)注啤酒中酒精度的問題一方面是想了解啤酒的其它指標(biāo)是否和生物胺有所關(guān)聯(lián);另一方面酒精與生物胺的毒性具有協(xié)同作用［13］，這也是考慮生物胺的危害性時(shí)需要考慮的問題。

為進(jìn)一步了解其內(nèi)在的規(guī)律，我們使用分析軟件對各類生物胺及其總量與原麥汁濃度、酒精度進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表4。可以看出，在0.05 的顯著性水平下，原麥汁濃度與酒精度和酪胺以及生物胺總量均相關(guān);在0.01 的顯著性水平下，酪胺與原麥汁濃度和酒精度相關(guān)，生物胺總量也與酒精度相關(guān)。酪胺的含量與濃度類指標(biāo)相關(guān)，說明這種胺可能受啤酒原料的影響較大。生物胺的總量與酒精度的關(guān)系比原麥汁濃度更加密切，說明啤酒的發(fā)酵度和生物胺也有一定的聯(lián)系。理論上，濃度影響到啤酒中所有水溶性物質(zhì)的含量，但并不是生物胺含量的主要影響因素，雖然從總體上分析可以看出原麥汁濃度與酒精度確實(shí)與生物胺總量有相關(guān)性，但對于個(gè)別樣品，這種相關(guān)性是很弱的，即包括發(fā)酵度在內(nèi)的發(fā)酵過程指標(biāo)應(yīng)該也會(huì)對成品酒中的生物胺含量產(chǎn)生影響。

表4 原麥汁濃度、酒精度與生物胺相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient between original wort concentration，alcohol content and biogenic amine content

3 結(jié)論

本研究以苯甲酰氯為衍生試劑，采用反相高效液相色譜法對8 種生物胺進(jìn)行分離和檢測，使用乙腈-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫。測定了市售的29 種啤酒中的生物胺含量，發(fā)現(xiàn)尸胺和亞精胺含量很低，組胺和苯乙胺依酒廠有不同含量不同，8 種生物胺總體含量為4.21 ～10.59 mg/L，遠(yuǎn)不能對人體健康構(gòu)成威脅。進(jìn)一步比較了不同原麥汁濃度、酒精度對生物胺含量的影響，結(jié)果表明從總體上二者與生物胺有一定聯(lián)系，但并非主要影響因素，因此發(fā)酵過程和發(fā)酵工藝等對啤酒中生物胺的影響可以深入研究。由于生物胺的檢測方法迅速，若能像其它食品建立其與微生物指標(biāo)的對應(yīng)關(guān)系，將會(huì)對啤酒發(fā)酵液中產(chǎn)生物胺且涂布培養(yǎng)生長緩慢的厭氧微生物的檢測提供有效、快速的方法。

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