張榮華 王冰

哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150025

為了達(dá)到基因治療的目的，目前已經(jīng)建立許多基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，這些方法為基因治療的最新進(jìn)展做出了很大的貢獻(xiàn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)就是將構(gòu)建出來(lái)的目的基因通過(guò)載體導(dǎo)入不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行基因功能研究的方法，轉(zhuǎn)染大致可分為物理轉(zhuǎn)導(dǎo)、化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)三種途徑。

物理轉(zhuǎn)導(dǎo)

是利用物理力量導(dǎo)致細(xì)胞膜的瞬間缺損，從而使DNA 質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的方法，如電穿孔法、基因槍法、注射法等。

注射法:直接將DNA 質(zhì)粒注射入組織細(xì)胞中以達(dá)到基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的。注射法還可以將裸露的DNA 質(zhì)粒注射入肌肉、肝臟、皮膚等組織，有研究報(bào)道將DNA 質(zhì)粒逆行注入到肝靜脈和膽管后能夠高效表達(dá)［1］。

基因槍法:是把壓縮氣體(氮或氦)轉(zhuǎn)換成氣體時(shí)所產(chǎn)生的沖擊波作為動(dòng)力，把DNA 質(zhì)粒直接射入組織、細(xì)胞和細(xì)胞器中，基因槍導(dǎo)入的基因被證明可在各種類(lèi)型的細(xì)胞中得到瞬時(shí)高效表達(dá)。

電穿孔法:通過(guò)短暫高強(qiáng)度的電場(chǎng)作用，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，將DNA 質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移方法。目前體內(nèi)用電穿孔法導(dǎo)入基因主要用于皮膚和肌肉組織。Molnar 等于2004 年［2］，采用電穿孔法將外源基因?qū)朊庖呷毕菔篌w內(nèi)，此基因穩(wěn)定表達(dá)超過(guò)1 年時(shí)間。王強(qiáng)等用電穿孔法將pGFP 質(zhì)粒導(dǎo)入K562 白血病細(xì)胞中［3］，獲得90%以上的表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)半年以上。錢(qián)鋒等通過(guò)電穿孔法使非貼壁細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染［4］。

化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)

化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)導(dǎo)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物通過(guò)細(xì)胞吞噬或吞飲作用將目的基因攜帶進(jìn)入靶細(xì)胞中。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo):1987 年，自從Felgner 等首次發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以轉(zhuǎn)移基因后［5］，大量被改良的陽(yáng)離子脂質(zhì)體用于轉(zhuǎn)移基因。在美國(guó)和歐洲，陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源的基因療法交付目前占正在進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)的9% ～12%［6］。劉志國(guó)等采用Lipofectine 轉(zhuǎn)染方法達(dá)到了外源基因在CHO 細(xì)胞中高效瞬時(shí)表達(dá)的目的［7］。

陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移:第一個(gè)被用于基因轉(zhuǎn)移的陽(yáng)離子聚合物是多聚賴(lài)氨酸，此后越來(lái)越多的分枝狀或線(xiàn)狀的陽(yáng)離子聚合物被用于外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中主要包括人工合成的如聚甲基丙烯酸(PMA)、聚乙烯亞胺(PEI)等［8］。孫祥明等將PEI 攜帶DNA 質(zhì)粒導(dǎo)入密度為1 ×107個(gè)/ml 細(xì)胞中［9］，轉(zhuǎn)染8 天后，在10．7L 培養(yǎng)液中收集到227mg 的EPO 蛋白。

病毒介導(dǎo)

將目的基因整合到特定的病毒中，通過(guò)病毒感染細(xì)胞，使目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中。能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘病毒和桿狀病毒。總的來(lái)說(shuō)，病毒體系時(shí)間長(zhǎng)代價(jià)高也比較復(fù)雜，操作不當(dāng)還可能有潛在的危險(xiǎn)。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，電穿孔法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子聚合物法和病毒法因轉(zhuǎn)染效率高，成為近年來(lái)應(yīng)用較多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。但每種方法也有其自身的局限性:電穿孔法細(xì)胞死率高;脂質(zhì)體法在體內(nèi)能夠引起免疫反應(yīng);陽(yáng)離子聚合物法有某些細(xì)胞毒性;病毒法則需考慮轉(zhuǎn)染后的安全因素。只有選擇合適的方法，才有利于外源基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)。

1 Zhang G，Vargo D，Budker V，et al．Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers［J］．Hum Gene Ther，1997(8):1763．

2 Molnar MJ，Gilbert R，Lu Y，et al．Factors influencing the efficacy，longevity，and safety of electroporation assisted plasmid based gene transfer into mouse muscles［J］．Mol Ther，2004(10):447．

3 王強(qiáng)，劉紅云，沈關(guān)心．綠色熒光蛋白白血病雞胚模型的構(gòu)建［J］． 華中醫(yī)學(xué)雜志，2006(1):67．

4 錢(qián)鋒，肖成組．電擊緩沖液對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞電穿孔效率的影響［J］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1999，23(2):101-103．

5 Felgner PL，Gadek TR，Holm M，et al．Lipofection:a highly effi cient，lipid mediated DNA transfection procedure［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1987(84):7413．

6 Alexander V Kabanov． Taking polycation gene delivery systems from in vitro to in vivo［J］．Today，1999，2(9):365-372．

7 劉志國(guó)，屈伸．DNA 高效轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞的研究． 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002(1):4-6．

8 Boussif O，Lezoualch F，Zanta MA，et al．A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995(92):7297．

9 Xiangming Sun，Hui Ching Hia，Peen Ern Goh，Miranda G．S．Yap． Highdensity transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells［J］．Biotechnology and Bioengineering，2008，1(99):108-116．