羅 淵，陸承榮，王 喆，段連寧，向培德，孫麗亞

空軍總醫(yī)院 臨床航空醫(yī)學(xué)實驗室，北京 100142

人角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的重要組成部分，不但可以產(chǎn)生角蛋白、形成角質(zhì)層，構(gòu)建完善的物理屏障；而且還可對部分抗原進(jìn)行攝取和分解，并可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與皮膚免疫應(yīng)答[1-2]。同時，它還是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞，在促進(jìn)傷口愈合、瘢痕形成以及再塑修復(fù)過程中起重要作用[3]。在炎性細(xì)胞因子和環(huán)境應(yīng)激作用下，可導(dǎo)致JNK、ERK等通路的激活，并參與諸如皮膚老化、黑色素瘤、病毒感染等疾病的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。MAPK有3個主要家族：ERK、JNK和p38MAPK。ERK通路主要參與細(xì)胞的增殖與分化，JNK通路和p38MAPK通路主要參與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和凋亡[7]。其中，JNK由3個同工酶組成，即組織中廣泛表達(dá)的JNK1、JNK2，以及在心臟、睪丸和腦中特異表達(dá)的JNK3。近來有研究報道JNK1和JNK2的功能存在一定的差異性，但其在角質(zhì)形成細(xì)胞中是否也存在差異仍不明確[8]。本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞系—Hacat細(xì)胞為研究對象，通過敲低其JNK1或JNK2的表達(dá)，探討JNK1和JNK2的功能差異性。

材料和方法

1 細(xì)胞系 人Hacat細(xì)胞和293T細(xì)胞為本實驗室常規(guī)保存。Hacat細(xì)胞的全培養(yǎng)基為含1×人類角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加劑(HKGS)的專用培養(yǎng)基。293T細(xì)胞的全培養(yǎng)基為含10%特級胎牛血清的高糖DMEM。依據(jù)細(xì)胞濃度，每2~3 d換液或消化、傳代。

2 主要試劑與儀器 人類角質(zhì)形成細(xì)胞生長添加劑(S0015)、專用培養(yǎng)基(M-EPI-500-CA)、含EDTA的胰酶(25200-072)、高糖DMEM(11965118)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX(15338-100)均購自美國Invitrogen公司。特級胎牛血清購自北京元亨圣馬公司。穿梭質(zhì)粒(plko.1)和包裝質(zhì)粒(PMD2G、psPAX2)均購于美國Addgene公司。JNK1/2 siRNA的oligo序列由Invitrogen公司合成。CCK-8試劑盒(CK-04)購自日本同仁化學(xué)研究所。細(xì)胞周期檢測試劑盒(340242)和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(559763)均購自美國BD公司。主要儀器設(shè)備包括：細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-15，日本三洋)、倒置相差顯微鏡(CK-3，日本奧林巴斯)、酶標(biāo)儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)、流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)。

3 慢病毒法建立JNK1、 JNK2敲低細(xì)胞株及鑒定根據(jù)在線網(wǎng)站工具(http：//jura.wi.mit.edu/siRNAext)設(shè)計針對JNK1和JNK2的siRNA靶序列，將靶序列代入穿梭質(zhì)粒的框架后送公司合成。分別將上下游oligo溶解后退火，與經(jīng)EcoRI和AgeI雙酶切后回收的plko.1載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選成功的重組載體。將293T細(xì)胞鋪板，密度為7×105細(xì)胞/60 mm平皿，加入2 μg穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒各1 μg進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，第2天換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收獲病毒液，經(jīng)0.44 μm過濾后分裝、凍存于-80 ℃。培養(yǎng)Hacat細(xì)胞，約5×105細(xì)胞/60 mm平皿，加入1 ml病毒液和3 ml全培養(yǎng)基，添加polybrene(8 μg/μl)，5 h后換新鮮培養(yǎng)基，48 h后加入嘌呤霉素(2 μg/μl)開始篩選。適當(dāng)收獲一些細(xì)胞，裂解后進(jìn)行JNK1、 JNK2的Western Blot鑒定。

4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖曲線 在96孔板中分別鋪Hacat細(xì)胞、JNK1和JNK2敲低細(xì)胞，每孔鋪104個細(xì)胞，檢測時間點設(shè)為0 h、18 h、36 h和54 h，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔和3個空白對照孔(不加CCK-8)。到相應(yīng)時間點時，向每個實驗孔中加入10 μl CCK-8，振蕩混勻后放回37 ℃孵箱再培養(yǎng)4 h，然后進(jìn)行雙波長酶標(biāo)儀檢測，主波長為450~490 nm，次波長為600~650 nm，以實驗孔OD值減去相應(yīng)的空白對照孔OD值為最終結(jié)果。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 在6孔板中分別鋪Hacat細(xì)胞、JNK1和JNK2敲低細(xì)胞，每孔鋪4×105個細(xì)胞，每種細(xì)胞各做3個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后開始血清饑餓24 h，即換成只含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基。第2天，重新?lián)Q成專用全培養(yǎng)基，啟動細(xì)胞增殖。24 h后胰酶消化細(xì)胞，收集后按BD細(xì)胞周期試劑盒進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 在6孔板中分別鋪Hacat細(xì)胞、JNK1和JNK2敲低細(xì)胞，每孔鋪4×105個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的Taxol(0 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 和 400 nmol/L)，每個劑量點做3個復(fù)孔。藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，按照BD凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。單因素方差分析檢驗Hacat細(xì)胞、JNK1和JNK2敲低細(xì)胞的組間差異，q檢驗進(jìn)行兩兩比較。

結(jié) 果

1 JNK1、JNK2敲低表達(dá)Hacat穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定 分別構(gòu)建JNK1、JNK2敲低的細(xì)胞株，JNK1(46 kU)敲低約50%，而JNK2(54 kU)幾乎完全敲除，結(jié)果見圖1，siRNA序列見表1。

表1 有效的針對JNK1/2的siRNA序列Tab.1 Sequences of JNK1/2 siRNA

2 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞增殖的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)早期(18 h)，三種細(xì)胞的增殖變化不明顯(P=0.626＞0.05)。培養(yǎng)中期(36 h)，三種細(xì)胞的增殖差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000＜0.05)。經(jīng)兩兩比較，對照組高于JNK1敲低組(P=0.000＜0.05)和JNK2敲低組(P=0.017＜0.05)，JNK2敲低組也高于JNK1敲低組(P=0.002＜0.05)。培養(yǎng)后期(54 h)，因未進(jìn)行細(xì)胞換液，部分細(xì)胞死亡，故OD值下降，見圖2。

3 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞周期的影響 三組細(xì)胞在G0/G1期的分布無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.245＞0.05)，而S期和G2/M期均有差異(P=0.000＜0.05)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，S期的JNK1敲低組低于對照組和JNK2敲低組(P=0.000＜0.05)，對照組和JNK2敲低組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.065＞0.05)。G2/M期的JNK1敲低組高于對照組和JNK2敲低組(P=0.000＜0.05)，對照組和JNK2敲低組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.088＞0.05)。可見，JNK1敲低使增殖期細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞阻滯于G2/M期，而JNK2敲低對細(xì)胞周期影響不大，見圖3。

4 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞凋亡的影響 在不同劑量點，組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，JNK2敲低組的凋亡率在每個劑量點都高于對照組和JNK1敲低組(P＜0.05)，而JNK1敲低組和對照組在100 nmol/L和400 nmol/L時差異不顯著，而在200 nmol/L時對照組凋亡率增高。表明JNK2抗凋亡作用高于JNK1，而JNK1可能有促凋亡作用，見圖4。

圖1 JNK1/2敲低效果的Western Blot鑒定(JNK1-46 kU、JNK2-54 kU)Fig.1 Western blot showing the knocked-down JNK1-46 kU and JNK2-54 kU

圖2 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞增殖的影響(CCK-8法)Fig.2 CCK-8 assay showing effect of knocked-down JNK1/2 on proliferation of Hacat cells

圖3 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞周期的影響(流式細(xì)胞術(shù)法)Fig.3 Flow cytometry showing effect of knocked down JNK1/2 on cell cycle of Hacat cells

圖4 JNK1/2敲低對Hacat細(xì)胞凋亡的影響(流式細(xì)胞術(shù)法)Fig.4 Flow cytometry showing effect of knocked-down JNK1/2 on apoptosis of Hacat cells

討 論

本研究利用慢病毒載體系統(tǒng)，成功構(gòu)建了JNK1或JNK2敲低表達(dá)的Hacat穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，先后進(jìn)行了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和Taxol的凋亡誘導(dǎo)實驗，通過和正常Hacat細(xì)胞對比，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)36 h后，JNK1/2敲低時細(xì)胞增殖顯著減緩，尤以JNK1敲低更顯著。細(xì)胞周期結(jié)果表明，啟動培養(yǎng)24 h后，三組細(xì)胞在G0/G1期的分布無統(tǒng)計學(xué)差異，而S期和G2/M期均有統(tǒng)計學(xué)差異。其中，在S期JNK1敲低組明顯低于對照組和JNK2敲低組，而JNK1敲低組的G2/M期明顯高于其余兩組，可見JNK1敲低使增殖期細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞阻滯于G2/M期，而JNK2敲低對細(xì)胞周期影響不大。凋亡誘導(dǎo)實驗表明，JNK2敲低組的凋亡率在每個劑量點都顯著高于對照組和JNK1敲低組，可見JNK2抗凋亡作用顯著高于JNK1，而JNK1甚至可能有促凋亡作用。初步表明，JNK1和JNK2的作用存在不同。在細(xì)胞增殖方面，JNK1作用強于JNK2；而在抗凋亡方面，JNK2作用強于JNK1。

目前，關(guān)于JNK的研究已較為深入，已發(fā)現(xiàn)MEK4和MEK7兩種直接上游激酶以及若干種下游 分 子， 如 c-Jun、ATF2、P53、Elk-1、c-Myc2、Bcl-2、Bim、BAD等[9]。Ke等學(xué)者的研究表明，在70%的人表皮細(xì)胞瘤中JNK2高度活化，而且通過藥物或基因方法抑制JNK2的活性可抑制腫瘤發(fā)生，可見JNK2的抗凋亡作用較大[8]。Liu等學(xué)者通過基因敲除小鼠也發(fā)現(xiàn)，TNF-α引起的凋亡在JNK1缺乏的成纖維細(xì)胞中受到抑制，而JNK2缺乏的反而增強，這與我們的研究結(jié)果一致[10]。而Zhong等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，JNK1可磷酸化Elk-1而導(dǎo)致TBP表達(dá)增高，并最終促進(jìn)增殖，而JNK2起抑制作用。相應(yīng)地，JNK1缺失時，細(xì)胞增殖變緩，而JNK2缺失時，細(xì)胞增殖加快[11]。這與我們的結(jié)果部分一致，可能是由不同細(xì)胞或不同刺激類型所致。

JNK在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中的作用機制錯綜復(fù)雜。不同的組織細(xì)胞來源、不同的刺激因素或不同的JNK同工酶，可激活不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[12]。大量的研究表明，JNK信號通路密切參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫性疾病等，而且可能是某些疾病的治療靶點[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)JNK1和JNK2在人類皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中存在不同的功能，尤其是抑制JNK2可以大大促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為皮膚疾病的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。但也存在一些不足，如本研究未對原代細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的驗證，而且沒有進(jìn)行JNK1/2過度表達(dá)的研究，這也是我們后續(xù)的研究思路。

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