牛 科，單 思，巴彩鳳

遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121001

星狀病毒(astroviruses)是一種主要引起人和動物以腹瀉癥狀為主的急性病毒性胃腸炎的單股正鏈RNA病毒[1]。人星狀病毒(human astroviruses，HAstV)主要感染5歲以下嬰幼兒、免疫抑制人群及老年人。1975年，Appleton和Higgins電鏡檢測兒童腹瀉糞便標本時發(fā)現(xiàn)HAstV。其基因全長6.4~7.3 kb，包括5'端非編碼區(qū)和3'端的polyA結(jié)構(gòu)，基因組中含三個ORF1a、ORF1b和ORF2開放閱讀框。ORF1a和ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白-衣殼蛋白(capsid protein)。因ORF2區(qū)是變異相對較高的區(qū)域，通過對ORF2的5'端基因序列分析將HAstV分為8個傳統(tǒng)的血清型(HAstV1-8)[2]。另外，美國學者利用宏基因組技術(shù)分離到HAstVMLB型、 VA型、 HMOASTV型3種新的病毒亞型[3-7]。本實驗應用生物信息軟件及互聯(lián)網(wǎng)在線數(shù)據(jù)分析工具對HAstV1衣殼蛋白序列進行分析，預測其二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)等空間結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量、理論等電點、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)等理化參數(shù)及親水性、柔韌性、抗原指數(shù)及表面可及性等生物學特性，為進一步完善星狀病毒基礎研究和臨床研究資料提供科學數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 基因序列 HAstV1衣殼蛋白GeneBank序列號：L23513，因特網(wǎng)(Internet)鏈接網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L23513。

2 蛋白理化參數(shù)分析 通過ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam軟件分析HAstV1衣殼蛋白的分子質(zhì)量、理論等電點、氨基酸組成、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均疏水性。

3 二級結(jié)構(gòu)預測與生物學特性分析 通過DNAStar軟件程序中的Editseq軟件將HAstV1衣殼蛋白中的基因序列翻譯成氨基酸序列，與GeneBank中的氨基酸序列校對，通過Protean模塊分析和預測蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其生物學特性。鏈接網(wǎng)址：http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input。應用immune epitope軟件中Kolaskar-Tongaonkar法預測HAstV1衣殼蛋白平均抗原指數(shù)。

4 三級結(jié)構(gòu)預測 通過在線數(shù)據(jù)分析工具Swiss-Model Workspace蛋白分析軟件預測HAstV1衣殼蛋白的三級結(jié)構(gòu)。然后，應用Swiss-pdb Wiewer軟件模擬蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

結(jié) 果

1 HAstV1衣殼蛋白氨基酸序列 翻譯后的氨基酸序列與GeneBank中一致。序列如下：MASKSNKQVTVEVSNNGRNRSKSRARSQSRGRDKSV KITVNSRNRARRQPGRDKRQSSQRVRNIVNKQLRKQ GVTGPKPAICQRATATLGTVGSNTSGTTEIEACILLNP VLVKDATGSTQFGPVQALGAQYSMWKLKYLNVKLT SMVGASAVNGTVLRVSLNPTSTPSSTSWSGLGARKH LDVTVGKNATFKLKPSDLGGPRDGWWLTNTNDNAS DTLGPSIEIHTLGRTMSSYKNEQFTGGLFLVELASEW CFTGYAANPNLVNLVKSTDNQVPVTFEGSAGSPLIMN VSEGSHFARTVLARSTTPTTLARAGERTTSDTVWQV LNTAVSAAELVTPPPFNWLVKGGWWFVKLIAGRTR TGSRSFYVYPSYQDALSNKPALCTGSTPGGMRTRNP VTTTLQFTQMNQPSLGHGEAPAAIGRSIPAPGEEYKV VLTFGSPMSPNANNKQTWVNKPLDAPSGHYNVKIAK DVDHYLTMQGFTSIASVDWYTIDFQPSEAPAPIKGLQ VLVNISKKADVYAVKQFVTAQTNNKHQVTSLFLVKV TTGFQVNNYLSYFYRASATGDATTNLLVRGDTYTAG ISFTQGGWYLLTNTSIVDGAMPPGWVWNNVELKTNT AYHMDKGLVHLIMPLPESTQMCYEMLTSIPRSRASG HGYESDNIEYLDAPDSADQFKEDIETDTDIESTEDED DEADRFDIIDTSDEEDGNETDRVTLLSTLVNQGMTMT RATRIARRAFPTLSDRIKRGVYMDLLVSGVSPGNAW SHACEEARKAVGETNPCTSGSRGHAE。

2 理化參數(shù)分析 通過ProtParam軟件分析，HAstV1衣殼蛋白序列編碼787個氨基酸；分子質(zhì)量為85 772.2；理論等電點為9.00；在構(gòu)成HAstV1衣殼蛋白的20種氨基酸中，蘇氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)占的比例最高，分別為10.3%和7.9%，其含72個負電荷氨基酸(AsP+Glu)， 82個正電荷氨基酸(Arg+Lys)；HAstV1衣殼蛋白的半衰期哺乳動物網(wǎng)組系統(tǒng)-體外為30 h，酵母-體內(nèi)＞20 h，大腸桿菌-體內(nèi)＞10 h；且其不穩(wěn)定系數(shù)為38.50，屬于穩(wěn)定性蛋白；脂肪系數(shù)為71.86；總平均疏水性為-0.435。

3 二級結(jié)構(gòu)預測與生物學特性分析 利用DNAStar-Protean軟件分析得到HAstV1衣殼蛋白具有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)，含有較多的α螺旋和β折疊等穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，及豐富的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等韌性結(jié)構(gòu)，且親水性區(qū)段、柔韌性區(qū)段、抗原指數(shù)較高及表面可及性大的區(qū)段分布亦較多(圖1)。通過immune epitope軟件中Kolaskar-Tongaonkar法預測HAstV1衣殼蛋白平均抗原指數(shù)為1.013，最大值為1.194，最小值為0.848，見圖2。

4 三級結(jié)構(gòu)預測 Swiss-Model Workspace應用PDB序列號3qsq為模板預測HAstV1衣殼蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖3)；并采用Swiss-pdbViewer蛋白質(zhì)分析軟件模擬HAstV1衣殼蛋白的分子表面模型(圖4)。由圖可知，HAstV1衣殼蛋白由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)組成規(guī)則的空間構(gòu)象。該構(gòu)象有7個由疏水氨基酸構(gòu)成的α-螺旋區(qū)域，位于蛋白的內(nèi)部；以8個疏水性殘基為主的β-折疊處于蛋白的中心，兩者共同構(gòu)成一個疏水核心區(qū)域；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等柔韌性結(jié)構(gòu)位于蛋白的外部，它們結(jié)構(gòu)比較松散，易扭曲變形。

圖2 HAstV1衣殼蛋白的抗原表位指數(shù)分析Fig.2 Antigenic epitope index for HAstV1 capsid protein

圖3 HAstV1衣殼蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of HAstV1 capsid protein

圖4 HAstV1衣殼蛋白分子表面模型Fig.4 Molecule surface of HAstV1 capsid protein

討 論

隨著信息時代的到來，生物信息學得到發(fā)展和廣泛應用。通過計算機軟件模擬和程序預測出各種核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化參數(shù)及生物學特性等信息或提供與之相關(guān)的輔助信息，從而用較低的成本和較快的時間獲得可靠的結(jié)果，大大的提高了實驗效率[8]。

本研究應用生物信息學理論分析HAstv1衣殼蛋白的理化參數(shù)與分子生物學特征發(fā)現(xiàn)，HAstv1衣殼蛋白是結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定蛋白且具有很好的抗原性，可以作為免疫用抗原，對進一步研究HAstV1檢測方法、病毒侵襲力、毒力以及病毒起源都具有非常重要的意義。該蛋白是研究HAstv1抗原性、生化特性、結(jié)構(gòu)功能的理想工具，可應用于HAstv1的免疫診斷和疫苗研制中。

1 Strain E， Kelley LA， Schultz-Cherry S， et al. Genomic analysis of closely related astroviruses［J］. J Virol， 2008， 82（10）： 5099-5103.

2 王永霞，段招軍，李宇寧．人星狀病毒研究進展［J］.病毒學報，2012，28（4）：482-487．

3 Finkbeiner SR， Holtz LR， Jiang Y， et al. Human stool contains a previously unrecognized diversity of novel astroviruses［J］. Virol J，2009， 6：161.

4 Finkbeiner SR， Li Y， Ruone S， et al. Identification of a novel astrovirus （astrovirus VA1） associated with an outbreak of acute gastroenteritis［J］. J Virol， 2009， 83（20）： 10836-10839.

5 De Benedictis P， Schultz-Cherry S， Burnham A， et al. Astrovirus infections in humans and animals - molecular biology， genetic diversity， and interspecies transmissions［J］. Infect Genet Evol，2011， 11（7）： 1529-1544.

6 Kapoor A， Li L， Victoria J， et al. Multiple novel astrovirus species in human stool［J］. J Gen Virol， 2009， 90（Pt 12）： 2965-2972.

7 Jeong AY， Jeong HS， Jo MY， et al. Molecular epidemiology and genetic diversity of human astrovirus in South Korea from 2002 to 2007［J］. Clin Microbiol Infect， 2011， 17（3）： 404-408.

8 Rubinstein ND， Mayrose I， Halperin D， et al. Computational characterization of B-cell epitopes［J］. Mol Immunol， 2008， 45（12）：3477-3489.