柳 高，朱 平

解放軍總醫(yī)院 南樓心血管一科，北京 100853

復(fù)方丹參滴丸在臨床的應(yīng)用日益廣泛，研究顯示該藥對(duì)冠心病心絞痛、高血壓左室肥厚、高血脂、腎功能不全等多種疾病均有治療作用。本研究在建立高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，觀察復(fù)方丹參滴丸降低血清尿酸(uric acid，UA)水平和保護(hù)血管內(nèi)皮的效果，并和傳統(tǒng)降尿酸藥物別嘌呤醇進(jìn)行比較，以求拓展復(fù)方丹參滴丸的臨床應(yīng)用領(lǐng)域，為降尿酸治療開辟新的路徑。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，貨號(hào)01-014)；別嘌呤醇片(重慶科瑞制藥有限公司)；鹽酸乙胺丁醇片(四川天臺(tái)山制藥有限公司)；復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司)；UA試劑盒、NO試劑盒(均為北京方寶生物科技有限公司產(chǎn)品)；兔來(lái)源抗小鼠、大鼠、人NF-κBp65(A)抗體，兔來(lái)源抗小鼠、大鼠、人VCAM-1(H-276)抗體(均為北京中杉金橋生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供的Santa-Cruz公司產(chǎn)品，工作濃度1∶100~1∶1 000)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 38只SPF級(jí)健康雄性昆明小鼠，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(38.43±3.81) g。隨機(jī)分為3組，對(duì)照組12只，別嘌呤醇組和復(fù)方丹參滴丸組各13只。

3 給藥劑量和方法 對(duì)照組(A組)：酵母膏15 g/(kg·d)+乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+適量蒸餾水；別嘌呤醇組(B組)：(酵母膏和乙胺丁醇劑量同上)+別嘌呤醇20 mg/(kg·d)；復(fù)方丹參滴丸組(C組)：(酵母膏和乙胺丁醇劑量同上)+復(fù)方丹參滴丸11.57 mg/(kg·d)。給藥容量：0.8 ml/只，1次/d，連續(xù)灌胃給藥3周。

4 血液標(biāo)本收集及檢測(cè) 給藥3周后各組小鼠依次用乙醚充分麻醉，摘眼球取血。血液標(biāo)本按照分組放入4 ℃冰箱冷藏靜置24 h后，在臺(tái)式高速低溫離心機(jī)10 ℃、3 000 r/min條件下離心5 min。將血清移至EP管中，-20 ℃冰箱分組冷凍保存。使用小鼠血清UA和血清NO酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒分別測(cè)定各組血清UA和血清NO水平。

5 主動(dòng)脈標(biāo)本NF-κB和VCAM-1檢測(cè) 將取血后的小鼠仰臥固定在操作臺(tái)上，眼科剪沿左右兩側(cè)腋前線剪開胸腔，剪去肺臟，充分暴露心臟。注射器抽取2 ml 10% PBS甲醛溶液由心尖處注入，從主動(dòng)脈弓處開始分離截取主動(dòng)脈約2~2.5 cm，同時(shí)取下心臟，將主動(dòng)脈及心臟標(biāo)本立即放入含有10% PBS甲醛溶液的試管中浸泡固定，經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，并進(jìn)行免疫組化檢測(cè)NF-κB和VCAM-1的蛋白表達(dá)(DAB試劑盒ZLI-9017和SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒PV-6000：美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)，中杉金橋生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司代理)。

6 主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察 使用OLYMPUS BX60顯微鏡，在400倍視野下重點(diǎn)觀察各組主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的改變和內(nèi)膜NF-κB、VCAM-1表達(dá)的強(qiáng)弱。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。定量數(shù)據(jù)用表示；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組血清UA、NO水平比較 試驗(yàn)中小鼠均未出現(xiàn)意外死亡。別嘌呤醇組和復(fù)方丹參滴丸組血清UA和NO水平與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示二者均能顯著降低血清UA水平，并提升血清NO水平；復(fù)方丹參滴丸組與別嘌呤醇組血清UA和NO水平差異也存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示復(fù)方丹參滴丸降低UA和提升NO的作用更加明顯，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠血清UA、NO水平比較Tab.1 UA and NO level of each group after the trial

2 主動(dòng)脈標(biāo)本HE染色 各組主動(dòng)脈內(nèi)膜形態(tài)和血管壁結(jié)構(gòu)均未發(fā)生改變，見(jiàn)圖1。

3 主動(dòng)脈內(nèi)膜NF-κB蛋白表達(dá) 對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜NF-κB可見(jiàn)連續(xù)陽(yáng)性表達(dá)，別嘌呤醇組和復(fù)方丹參滴丸組表達(dá)均有減弱，復(fù)方丹參滴丸組減弱更加明顯，見(jiàn)圖2。

4 主動(dòng)脈內(nèi)膜VCAM-1蛋白表達(dá) 對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜VCAM-1可見(jiàn)連續(xù)陽(yáng)性表達(dá)，別嘌呤醇組和復(fù)方丹參滴丸組表達(dá)均有減弱，復(fù)方丹參滴丸組減弱更加明顯，見(jiàn)圖3。

討 論

早期研究提示丹參的有效成分丹參酮ⅡA具有抑制黃嘌呤氧化酶(XO)活性的作用，而XO是體內(nèi)UA合成的關(guān)鍵酶，對(duì)于UA的生成意義重大[1]。張霞、吳慧也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間服用治療劑量復(fù)方丹參滴丸對(duì)XO的活性具有抑制作用[2-3]。本研究中復(fù)方丹參滴丸組小鼠血清UA水平與對(duì)照組相比下降明顯，證實(shí)了復(fù)方丹參滴丸具有降低UA的作用，其機(jī)制考慮與抑制XO活性，減少了UA的產(chǎn)生有關(guān)。

研究提示血清UA水平和血清同型半胱氨酸(Hcy)水平存在正相關(guān)，Malinow認(rèn)為其可能機(jī)制是由S-腺苷-同型半胱氨酸產(chǎn)生的腺苷，優(yōu)先摻入U(xiǎn)A的前體池，將Hcy和UA的合成相關(guān)聯(lián)[4-5]。二者均通過(guò)抑制NO產(chǎn)生、增強(qiáng)過(guò)氧化物反應(yīng)和炎性反應(yīng)等途徑，造成血管內(nèi)皮損傷[6-7]。Liang等[8]研究顯示，中藥制劑通心絡(luò)膠囊能夠上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)、激活PI-3K/Akt/HIF依賴的信號(hào)途徑，增加NO釋放，從而改善血管內(nèi)皮功能，減輕高同型半胱氨酸血癥(HHcy)對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，而復(fù)方丹參滴丸和通心絡(luò)膠囊在制藥配方上有相同之處。藥理研究還證明，復(fù)方丹參滴丸能清除氧自由基、減少脂質(zhì)過(guò)氧化物、降低血脂，抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)其有效成分丹參素可直接通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA的表達(dá)水平，控制ET產(chǎn)生與分泌，提高血中NO濃度，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，提示復(fù)方丹參滴丸具有直接升高血NO的效果[9]。本研究中復(fù)方丹參滴丸引起血清NO水平升高，除上述直接原因外，可能還與UA水平降低后繼而引起Hcy水平下降、或者直接降低Hcy水平有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參的活性成分之一咖啡酸(caffeic acid，又名3，4-二羥基肉桂酸)具有抑制HHcy加速的小鼠腦靜脈中白細(xì)胞滾動(dòng)和黏附作用，提示其可能成為針對(duì)HHcy的治療新策略[10]。但是復(fù)方丹參滴丸是否具有降低Hcy的作用及其具體機(jī)制，仍有待進(jìn)一步闡明。

圖1 小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本HE染色(×400)(箭頭所指為主動(dòng)脈內(nèi)膜)A：對(duì)照組； B：別嘌呤醇組； C：復(fù)方丹參滴丸組Fig.1 HE staining of mouse aorta specimen(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

圖2 小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜NF-κB蛋白表達(dá)(×400)(箭頭所指為主動(dòng)脈內(nèi)膜)A：對(duì)照組； B：別嘌呤醇組； C：復(fù)方丹參滴丸組Fig.2 Expression of NF-κB protein in mouse aortic endomembrane(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

NF-κB作為早期轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控參與早期免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)各階段的許多分子，其表達(dá)程度可以直觀地反映動(dòng)脈血管內(nèi)皮出現(xiàn)炎性反應(yīng)和損傷的程度。VCAM-1是內(nèi)皮細(xì)胞損傷或活化的標(biāo)志物，在內(nèi)皮細(xì)胞受損或活化的情況下表達(dá)將會(huì)明顯增加。本研究的免疫組化結(jié)果提示別嘌呤醇和復(fù)方丹參滴丸均對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用，而且復(fù)方丹參滴丸的保護(hù)作用更加顯著。

總之，本研究通過(guò)短期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證了復(fù)方丹參滴丸具有降低血清UA和保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。今后隨著對(duì)復(fù)方丹參滴丸藥理作用認(rèn)識(shí)的不斷深入，我們?cè)贖UA患者中也將開展長(zhǎng)期的臨床相關(guān)研究，其結(jié)果可能在目前傳統(tǒng)降UA藥物不良反應(yīng)多、療效不佳，且新型降UA藥物比較匱乏的大環(huán)境下，為臨床降UA和血管保護(hù)治療提供一條嶄新的途徑。

1 張海德，黃玉林，何繼芹.丹參二萜醌對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007，21（3）：174-178.

2 張霞．復(fù)方丹參滴丸對(duì)人體黃嘌呤氧化酶活性的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（19）：1622-1624．

3 吳慧，張霞．復(fù)方丹參滴丸對(duì)藥物代謝酶CYP1A2，NAT2和XO活性影響的研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2009，26（1）：8-11．

4 郭存九，朱愛(ài)萍，黃淑田，等．應(yīng)用受試者特性曲線分析血清膽紅素尿酸和同型半胱氨酸對(duì)冠心病診斷的臨床價(jià)值［J］.中國(guó)藥物與臨床，2009，9（1）：26-29．

5 Malinow MR， Levenson J， Giral P， et al. Role of blood pressure， uric acid， and hemorheological parameters on plasma homocyst（e）ine concentration［J］. Atherosclerosis， 1995， 114（2）： 175-183.

6 Leyva F， Anker S， Swan JW， et al. Serum uric acid as an index of impaired oxidative metabolism in chronic heart failure［J］. Eur Heart J， 1997， 18（5）： 858-865.

7 王枚，李霞．高同型半胱氨酸血癥與心腦血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（22）：3444-3447．

8 Liang JQ， Wu K， Jia ZH， et al. Chinese medicine Tongxinluo modulates vascular endothelial function by inducing eNOS expression via the PI-3K/Akt/HIF-dependent signaling pathway［J］. J Ethnopharmacol， 2011， 133（2）： 517-523.

9 趙然尊， 樊啟財(cái)， 劉志江， 等. 復(fù)方丹參滴丸對(duì)冠心病合并2型糖尿病患者ET、NO的影響［J］.山東醫(yī)藥， 2009， 49（1）：110.

10 程絲，馮娟，王憲．高同型半胱氨酸血癥治療研究進(jìn)展［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2011，42（5）：329-334．