超高壓輔助濁點(diǎn)萃取法提取富集蓮子心總生物堿

朱榮華 ，王曉 ，劉建華 ，張樹(shù)芹，劉峰

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018;2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014)

植物中活性成分的提取、富集是分離與分析的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。近年來(lái)一些新技術(shù)，如超臨界流體萃?。?］、微波輔助提?。?-3］等已被廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的提取過(guò)程中，但是這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，能耗高等缺點(diǎn)。超高壓提取(ultrahigh pressure extraction，UPE)是利用100 MPa 以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液，保壓一段時(shí)間(幾分鐘)后卸壓，從而達(dá)到提取的目的［4-5］，已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取，如葡萄皮中提取花青素［6］、茶葉中提取茶多酚［7］、荔枝果皮中提取黃酮類(lèi)化合物［8］和人參中提取人參皂苷［9］等。該方法與傳統(tǒng)技術(shù)相比，可以大大縮短提取時(shí)間、降低能耗、減少雜質(zhì)成分的溶出，提高有效成分的收率，避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低［10-11］。濁點(diǎn)萃取(cloud point extraction，CPE)是以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，通過(guò)改變一定的萃取條件(如電解質(zhì)、溫度、時(shí)間等)，達(dá)到將水溶性物質(zhì)與親油性物質(zhì)分離的目的［12］。該方法完全取代了有機(jī)溶劑，具有經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)［13］，有著廣闊的應(yīng)用前景。因此，超高壓提取與濁點(diǎn)萃取技術(shù)相結(jié)合，可在無(wú)有機(jī)溶劑條件下實(shí)現(xiàn)快速提取、富集天然產(chǎn)物中的有效成分。目前，超高壓-濁點(diǎn)萃取技術(shù)提取、富集天然產(chǎn)物有效成分的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

蓮子心是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的綠色胚芽，主要成分為生物堿，包括甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿等［14］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蓮子心具有抗多種實(shí)驗(yàn)性心律失常、抗血小板聚集及降壓等作用［15］。

本文對(duì)超高壓-濁點(diǎn)萃取蓮子心中生物堿的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過(guò)表面活性劑類(lèi)型、濃度、提取壓力、時(shí)間、料液比等單因素實(shí)驗(yàn)確定了液-固提取工藝條件;進(jìn)一步通過(guò)NaCl 濃度、平衡溫度、平衡時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)確定了濁點(diǎn)萃取富集條件。結(jié)果表明，此方法可在極短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)蓮子心生物堿的提取、富集。

1 儀器和試劑

1.1 儀器與設(shè)備

HPP.L3-600 型超高壓生物提取設(shè)備(天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司);UV-2550 型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);AE240 分析天平(METTLER 公司)。

1.2 原料與試劑

蓮子心購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯藥店，甲基蓮心堿對(duì)照品購(gòu)自天然產(chǎn)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品參比實(shí)驗(yàn)室;烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、氯化鈉為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、無(wú)水乙醇為分析純，均購(gòu)自濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超高壓提取方法

稱(chēng)取一定量的樣品，轉(zhuǎn)入聚乙烯塑料袋中，按照一定的料液比加入溶劑，密封。在一定壓力下，提取一定時(shí)間，卸壓后，過(guò)濾，得提取液，分析總生物堿含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值。

2.2 濁點(diǎn)萃取方法

將上述過(guò)濾后的提取液中加入一定量的NaCl，混勻，放入設(shè)定溫度的恒溫水浴中加熱。平衡一段時(shí)間后，進(jìn)行離心分離，使表面活性劑相與水相分離。分別量取兩相體積并測(cè)定兩相中蓮子心生物堿的含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取平均值。

2.3 總生物堿含量測(cè)定

精確配制0.50 mg/mL 的甲基蓮心堿對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋2、5、10、20、50 倍后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于280 nm 下分別測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，甲基蓮心堿濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程:Y=-0.04826+12.52484X，R2=0.9992。

分別取提取液、表面活性劑相、水相溶液100 μL 用去離子水稀釋定容至10 mL，測(cè)定總生物堿含量，計(jì)算提取率及萃取回收率。

2.4 萃取回收率及濃縮系數(shù)

萃取回收率=表面活性劑相總生物堿的濃度/提取液總生物堿的濃度;

濃縮系數(shù)(CF)=濃縮分層后水相體積/表面活性劑相體積。

3 結(jié)果與討論

3.1 液-固提取

3.1.1 表面活性劑的選擇

稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉，分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10、Triton X-100、SDS、SDBS、甲醇、乙醇溶液為提取溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，在壓力200 MPa 下提取2 min，不同提取溶劑對(duì)提取率影響如圖1(A)所示。

從圖1(A)可知，OP-10、SDS 比其他溶液具有更高的提取效率，但是SDS 的Krafft 點(diǎn)在8℃左右，后續(xù)萃取階段較難控制，而OP-10 的濁點(diǎn)為65～80℃，易于進(jìn)行后續(xù)濁點(diǎn)萃取階段的操作，綜合以上因素最終選擇OP-10 水溶液作為溶劑。

3.1.2 OP-10 水溶液濃度對(duì)提取率的影響

稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%、9%的OP-10 水溶液作為提取溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，在壓力200 MPa 下提取2 min，不同提取溶劑濃度對(duì)提取率影響如圖1(B)所示。

表面活性劑具有親水基和疏水基，達(dá)到臨界膠束后，可以形成疏水基在里的膠束團(tuán)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮心生物堿的提取作用依靠的就是表面活性劑溶液中所形成的膠束。從圖1(B)中可以看出OP-10 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～5%之間，提取率隨著溶劑濃度的增大呈上升趨勢(shì)，原因是隨著表面活性劑溶液濃度的增大，形成的膠束越來(lái)越多，增溶作用越強(qiáng)，越有利于總生物堿的提取。但在OP-10 質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于5%之后，隨著濃度的增大提取效率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著表面活性劑濃度的增大，溶液黏度增大，擴(kuò)散能力減弱，膠束難滲入到蓮子心樣品基質(zhì)的內(nèi)部，導(dǎo)致提取率降低。因此，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為最佳提取溶劑。

3.1.3 壓強(qiáng)對(duì)提取率的影響

稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，分別在100、200、300、400、500 MPa 高壓下提取2 min，結(jié)果見(jiàn)圖1(C)。

超高壓提取的過(guò)程是先對(duì)物料加壓，保持一定時(shí)間后，突然卸壓。由于在增壓過(guò)程中，蓮子心細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)超高壓差，溶劑在壓力作用下迅速滲透到細(xì)胞內(nèi);卸壓過(guò)程中壓力由幾百兆帕迅速降為常壓，同樣，在內(nèi)外壓差作用下，有效成分從細(xì)胞內(nèi)向周?chē)軇﹥?nèi)擴(kuò)散，從而大大加快了有效成分向外擴(kuò)散的速率［16］。

從圖1(C)中可以看出，在100～500 MPa 之間，隨著超高壓壓力的升高，提取率略有下降。說(shuō)明壓力在達(dá)到100 MPa 時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已被充分破壞，目標(biāo)化合物已充分溶出，當(dāng)壓力增大，溶劑粘度增加，擴(kuò)散能力減弱，提取率略有下降。因此，提取壓力選擇100 MPa。

3.1.4 保壓時(shí)間對(duì)提取率的影響

稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為溶劑，固定料液比1:40 (g/mL)，100 MPa 高壓下分別提取1、2、3、4、5 min，結(jié)果見(jiàn)圖1(D)。

從圖1(D)中可以看出，在1～5 min 之間，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率略有下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取溶劑在高壓作用下，進(jìn)入蓮子心細(xì)胞內(nèi)，100 MPa 高壓下蓮子心的細(xì)胞破裂很快，在這1 min 內(nèi)已經(jīng)充分破裂，并且超高壓力引起體系的體積變化，推動(dòng)了化學(xué)平衡的移動(dòng)，溶劑的滲透、溶質(zhì)的溶解快速達(dá)到平衡［16］。從效率和能耗等方面綜合考慮，1 min 為最佳時(shí)間。

3.1.5 料液比對(duì)提取率的影響

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 溶液為溶劑，分別按照料液比1:5，1:10，1:20，1:30，1:40 (g/mL)，100 MPa 高壓下提取1 min，結(jié)果見(jiàn)圖1(E)。

如圖1(E)所示，在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，表面活性劑的量增加，膠束作用越強(qiáng)，溶劑對(duì)總生物堿的提取效果越好，但是達(dá)到一定的濃度后，溶劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)總生物堿的充分提取，再增大料液比提取率基本不變，因此本實(shí)驗(yàn)的最佳料液比為1:20。

圖1 超高壓提取影響因素對(duì)提取率的影響Fig.1 Impact of ultrahigh pressure-assisted micellar extraction on the extraction yield of total alkaloids

超高壓輔助表面活性劑提取蓮子心中生物堿的最佳工藝條件如表1 所示，按照上述條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，蓮心生物堿的提取率可以達(dá)到103.6 mg/g。

表1 最佳提取工藝條件Table 1 The optimal conditions of the extraction process

3.2 液-液萃取

3.2.1 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取回收率的影響

完成提取后過(guò)濾，向?yàn)V液中加入一定量的NaCl，使NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%、10%、12%、15%、17%、20%，恒溫65℃水浴加熱10 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結(jié)果如圖2(A)所示。

溶液中加入電解質(zhì)NaCl 可增大OP-10 膠團(tuán)的聚集數(shù)，并降低表面活性劑濃縮相中自由水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和減少溶質(zhì)在水相的溶解度，從而提高其對(duì)蓮心生物堿的增溶能力并且減小表面活性劑相的體積，另外，無(wú)機(jī)鹽可以改變非離子表面活性劑的濁點(diǎn)溫度［17］。圖2(A)表明，隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，濃縮系數(shù)一直呈上升趨勢(shì)，萃取回收率值在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到15%后達(dá)到平衡，再增加NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取回收率值基本沒(méi)有影響，而且加入過(guò)多的NaCl 難以溶解，因此15%為最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖2 濁點(diǎn)萃取各因素對(duì)萃取回收率和濃縮系數(shù)的影響Fig.2 Impacts of CPE factors on CPE extraction yield and CF

3.2.2 平衡溫度對(duì)萃取回收率的影響

完成提取后過(guò)濾，向?yàn)V液中加入NaCl，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%，再分別以恒溫30、40、50、60、65、70℃水浴加熱10 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結(jié)果如圖2(B)所示。

隨著平衡溫度的上升，膠束中氫鍵斷裂脫水，使表面活性劑富集相體積減少，引發(fā)更好的相分離。圖2(B)表明，隨著溫度的上升，濃縮系數(shù)一直呈上升趨勢(shì)，萃取回收率值在30～50℃間呈上升趨勢(shì)，在50℃之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是溫度過(guò)高，蓮心生物堿穩(wěn)定性下降，部分生物堿被破壞。所以最佳的平衡溫度是50℃。

3.2.3 平衡時(shí)間對(duì)萃取回收率的影響

完成提取后過(guò)濾，向?yàn)V液中加入NaCl，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%，分別在50℃恒溫水浴加熱5、10、15、20、25 min 后，2 000 r/min 離心4 min，結(jié)果如圖2(C)所示。

在合適的電解質(zhì)和濁點(diǎn)溫度下，足夠的平衡時(shí)間可以使表面活性劑充分的提取富集目標(biāo)成分。從圖2(C)可知，在50℃恒溫水浴條件下，平衡時(shí)間對(duì)萃取回收率和濃縮系數(shù)影響不大，濃縮系數(shù)基本保持不變，萃取回收率值在平衡時(shí)間達(dá)到10 min 后也基本保持不變。所以平衡時(shí)間選擇為10 min。最佳富集工藝條件見(jiàn)表2。

表2 最佳富集工藝條件Table 2 The optimal conditions of the enrichment process

2.3 最優(yōu)化條件

綜上所述，超高壓輔助膠束提取蓮子心生物堿的最佳提取工藝為提取壓力100 MPa，提取時(shí)間1 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% OP-10 為溶劑，料液比1:20 (g/mL)，蓮心生物堿的提取率達(dá)到103.6 ±2.6 mg/g。提取液中加入NaCl 使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%再在50℃條件下平衡10 min，兩相分離，離心后蓮子心生物堿的萃取回收率為70.73% ±1.34%，濃縮系數(shù)為8.6 ±0.2。

4 結(jié)論

本文利用超高壓輔助膠束提取結(jié)合濁點(diǎn)萃取技術(shù)從蓮子心中提取富集了蓮心生物堿，與傳統(tǒng)方法相比，超高壓提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、能耗低。同時(shí)，超高壓處理后的提取液成分較簡(jiǎn)單，不渾濁，粘度低，易過(guò)濾，有利于后續(xù)操作。常溫提取又能使蓮子心生物堿避免因熱效應(yīng)損失和藥理活性降低。超高壓輔助膠束提取結(jié)合濁點(diǎn)技術(shù)是在密閉的環(huán)境下常溫進(jìn)行的，沒(méi)有溶劑揮發(fā)，綠色環(huán)保，是一種提取和富集蓮子心中生物堿的新方法。

［1］KARLSSON L，TORSTENSSON A，TAYLOR L T，et al.The use of supercritical fluid extraction for sample preparation of pharmaceutical formulations［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997，15(5):601 -611.

［2］FANG L，LIU Y Q，ZHUANG H Y，et al.Combined microware-assisted extraction and high-speed counter-current chromatography for separation and parification of xanthones from Garcinia mangostana［J］.Journal of Chromatography B，2011，879(28):3023 -3027.

［3］LIU Y Q，GUO X F，DUAN W J，et al.Accelerated solvent extraction of monacolin K from red yeast rice and purification by highspeed counter-current chromatography［J］.Journal of Chromatography B，2010，878(28):2881–2885.

［4］張格，張玲玲，吳華，等.采用超高壓技術(shù)從茶葉中提取茶多酚［J］.茶葉科學(xué)，2006，26(4):291 -294.

［5］ZHANG S Q，CHEN R Z，WANG C Z.Experiment study on ultrahigh pressure extraction of Ginsenosides［J］.Journal of Food Engineering，2007，79(1):1 -5.

［6］CORRALES M，GARCI A F，BUTZ P，et al.Extraction of anthocyanins from grape skins assisted by high hydrostatic pressure［J］.Journal of Food Engineering，2009，90 (4):415 -421.

［7］XI J，SHEN D J，ZHAO S，et al.Characterization of polyphenols from green tea leaves using a high hydrostatic pressure extraction［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，382(1/2):139 -143.

［8］PRASAD K N，YANG B，ZHAO M M，et al.Application of ultrasonication or high-pressure extraction of flavonoids from litchi fruit pericarp［J］.Journal of Food Process Engineering，2009，32 (6):828 -843.

［9］SHIN J S，AHN S C，CHOI S W，et al.Ultra high pressure extraction(VHPE)of ginse-nosides from Korean panax ginseng powder［J］.Food Science and Biotechnology，2010，19(3):743 -748.

［10］曾亮，羅理勇，官興麗.超高壓提取茶葉內(nèi)含物工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32(6):85 -88.

［11］PRASAD K N，YANG B，SHI J，et al.Enhanced antioxidant and antityrosinase activities of longan fruit pericarp by ultra-highpressure-assisted extraction［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51 (2):471 -477.

［12］姬厚偉，張建勛.現(xiàn)代萃取技術(shù)及其在煙草化學(xué)分析中的應(yīng)用［J］.煙草科技，2007(9):46 -50.

［13］SHI Z H，HE J T，CHANG W B.Micelle-mediated extraction of tanshinones from Salvia miltiorrhiza bunge with analysis by highperformance liquid chromatography［J］.Talanta，2004，64(2):401 -407.

［14］張弦，潘揚(yáng).植物蓮中生物堿類(lèi)成分的研究概況［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，18(6):382 -384.

［15］婁紅祥，苑輝卿，季梅.蓮子心化學(xué)成分的研究［J］.山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，33(4):346 -348.

［16］陳瑞戰(zhàn)，張守勤，劉志強(qiáng).超高壓技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用［J］.中草藥，2007，38(12):1905 -1908.

［17］TIAN M L，YAN H Y，ROW K H.Solid-phase extraction of tanshinones from Salvia Miltiorrhiza Bunge using ionic liquidmodified silica sorbents［J］.Journal of Chromatography B，2009，877(819):738 -742.