楊 磊，王鳳龍*，丁玉林，丁旭娜，劉德明，趙占寬

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能夠作用于腫瘤細(xì)胞使腫瘤細(xì)胞壞死或凋亡，同時(shí)TNF-α作為一種重要的炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖過(guò)程[1-3]。正常狀態(tài)下，適量TNF-α的表達(dá)可調(diào)節(jié)炎癥部位淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞的功能，對(duì)保護(hù)宿主是必要的。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)TNF-α的研究多數(shù)集中在其對(duì)腫瘤的殺傷，組織的修復(fù)等方面。對(duì)于奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Bovinemammary epithelial cells，BMEC）的研究主要在凋亡作用方面，未見(jiàn)TNF-α對(duì)BMEC表達(dá) α- 平 滑 肌 肌 動(dòng) 蛋 白 （α-smooth muscle actin，α-SMA）的影響和對(duì)奶牛乳腺纖維化作用的相關(guān)報(bào)道。組織器官的纖維化過(guò)程主要取決于細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）的沉積、分解以及細(xì)胞凋亡等，ECM主要由活化的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞（Myofibroblast，MFB）合成與分泌形成。MFB為促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞，能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型、Ⅲ膠原和纖黏連蛋白，是腎纖維化以及其他組織纖維化中使細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多的主要原因之一，該細(xì)胞可以表達(dá)α-SMA、波形蛋白和成纖維細(xì)胞特異性抗原（FSP-1）[4-5]。此外，在纖維化過(guò)程中某些實(shí)質(zhì)細(xì)胞也可以通過(guò)轉(zhuǎn)分化為MFB合成與分泌形成ECM[6]。有報(bào)道稱(chēng)TNF-α能夠促進(jìn)人F3-4成纖維細(xì)胞增殖，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖也有明顯促進(jìn)作用，并促進(jìn)其Ⅰ、Ⅲ膠原和糖胺多糖合成。TNF-α還能夠消除TGF-β1對(duì)人、鼠肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞合成分泌纖維連接蛋白（FN）和蛋白多糖。也可以促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖分化和ECM的合成。

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度外源性TNF-α作用BMEC，分別于不同時(shí)間采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，同時(shí)用western blot測(cè)定其蛋白表達(dá)。為奶牛乳腺纖維化致病機(jī)制及奶牛乳腺炎的防治提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物組織來(lái)源 妊娠后期健康荷斯坦奶牛1頭（未經(jīng)產(chǎn)）購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古呼和浩特市郊區(qū)，采用無(wú)菌外科手術(shù)的方法采取奶牛乳腺組織，分離乳腺腺泡，并用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 重組人TNF-α購(gòu)自Peprotech公司；抗Keratin 18單克隆抗體（MAb）、抗Vimentin MAb購(gòu)自Neomarker公司；SYBR Primescipt real-time RT-PCR Kit、RNA iso plus、DNA Marker購(gòu)自 TaKaRa公司；小鼠β-actin抗體（ab6276）、兔抗a-SMA抗體（ab5694）均購(gòu)自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 BMEC的純化培養(yǎng)與鑒定 采用差時(shí)胰酶消化法結(jié)合差速反復(fù)貼壁法對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞純化3次～5次，去除成纖維細(xì)胞，以得到純凈的BMEC，采用免疫組織化學(xué)的方法鑒定純化的細(xì)胞對(duì)Keratin 18的反應(yīng)，以確保細(xì)胞的純度。

1.4 TNF-α培養(yǎng)液的配制 以ddH2O將TNF-α稀釋為1.0mg/mL，以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至100 ng/mL。使用前用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋TNF-α至終濃度為1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。

1.5 TNF-α作用的BMECα-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 將純化鑒定的乳腺上皮細(xì)胞（6代～8代）用0.25%胰酶于37℃消化4 Min～8 Min，以含10%血清的培養(yǎng)液中止消化，懸細(xì)胞液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按5×105/mL的細(xì)胞濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)液處理24 h后，加入含有不同濃度（1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL）TNF-α的細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)照組加入不含TNF-α的培養(yǎng)液。分別作用12 h、24 h、48 h、72 h后用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)變化，并用RNA iso plus提取細(xì)胞總RNA，每個(gè)濃度劑量組設(shè)6個(gè)重復(fù)，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.1 α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測(cè)定根據(jù)GenBank中 α-SMA和β-actin的序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1），用反轉(zhuǎn)錄試劑中的EASY Dllution對(duì)cDNA（50 ng/μL）進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)♂尯骳DNA終濃度分別為：5×101ng/μL～5×10-6ng/μL。分別以其為模板進(jìn)行 realtime PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：SYBR Primer EXTaqTMⅡ （2×）12.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 2μL、ddH2O 8.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s、95℃5 s、60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；繪制熔解曲線(xiàn)。選取線(xiàn)性較好的4個(gè)～6個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；并以β-actin為內(nèi)參，以等量相應(yīng)的cDNA為模板平行擴(kuò)增α-SMA。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 primers sequence and product size

1.6 Western blot檢測(cè) TNF-α 作用 BMEC中α-SMA的表達(dá) BMEC經(jīng)無(wú)血清處理24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗。25 cm2培養(yǎng)瓶中加入250μL裂解液，冰上裂解。刮取細(xì)胞，吸出裂解液于1.5 ML EP管中，12 000 r/m in，4℃離心 5 min～10 min。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品取2次測(cè)定的平均值，然后用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BEMC免疫組化鑒定結(jié)果 采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，待成乳腺纖維細(xì)胞（BMFB）和BMEC從組織塊周邊先后游出后，至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底壁80%時(shí)，用差速胰酶消化結(jié)合反復(fù)貼壁法純化上皮細(xì)胞。純化后的BMEC，分別以PBS和角蛋白-18作為一抗進(jìn)行免疫組化鑒定上皮細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，以角蛋白-18作為一抗檢測(cè)的BMEC胞漿內(nèi)出現(xiàn)了棕色反應(yīng)顆粒沉積，而以PBS作為一抗的對(duì)照組未出現(xiàn)（圖1）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)利用內(nèi)參基因β-actin和目的基因α-SMA進(jìn)行real-time RT-PCR檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2C、D）。其引物反應(yīng)性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98，擴(kuò)增效率均在0.8～1.2之間。β-actin在10 ng～0.1 pg之間均可得到良好的定量結(jié)果，α-SMA在100 ng～1 pg之間均可得到良好的定量結(jié)果。

2.2.2 相對(duì)定量結(jié)果以各濃度劑量組TNF-α作用于體外培養(yǎng)BMEC，各組內(nèi)參基因β-actin和目的基因α-SMA，分別設(shè)6個(gè)重復(fù)，并重復(fù)檢測(cè)兩次，其擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)圖2A和B；熔解曲線(xiàn)峰單一，各組起峰時(shí)間一致，無(wú)雜峰（圖2C、D）；所得結(jié)果穩(wěn)定，Ct值均在10～20之間。用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，12 h各濃度處理組和24 h 10 ng/mL處理組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯升高（p<0.05）；48 h和72 h各處理組與對(duì)照組相比差異不顯著（p>0.05）；并且48 h各處理組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組有所降低（圖3）。

圖2 β-actin和α-SMA實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve,amplification curve and melting curve of β-actin and α-SMA analyzed by real-time quantitative PCR

圖3 α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨TNF-α不同作用濃度和時(shí)間的變化Fig.3 The relative expression ofα-SMA mRNA effected w ith TNF-αat differential concentration and time

2.3 Western blot檢測(cè) TNF-α各濃度處理組BMEC的β-actin的表達(dá)量基本一致，而α-SMA的表達(dá)量很低，基本檢測(cè)不到（圖4）。除24 h對(duì)照組和10 ng/mL組條帶清晰，明顯高于其他濃度處理組外，其他時(shí)間點(diǎn)各處理組均未檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)。

圖4 α-SMA蛋白的表達(dá)量隨TNF-α不同作用濃度和時(shí)間的變化Fit.4 The expression ofα-SMA protein effected with TNF-α at differential concentration and time

3 討 論

現(xiàn)有報(bào)道表明，TNF-α能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞和肝臟星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞[7-8]。而TNF-α能否促進(jìn)BMEC轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞還未見(jiàn)報(bào)道。RT-PCR結(jié)果顯示，12 h各濃度劑量組和24 h 10 ng/mL處理組TNF-α與對(duì)照組相比差異顯著，并且隨著TNF-α濃度劑量的增加α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量基本呈遞增趨勢(shì)。這與張勉之[7]報(bào)道的TNF-α能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)α-SMA、陳曉紅等報(bào)道的TNF-α能夠促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞表達(dá)α-SMA的結(jié)果一致。48 h和72 h各劑量組與對(duì)照組相比差異不顯著，并且在48 h各劑量組α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，這可能與TNF-α誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的凋亡有關(guān)。關(guān)于肝臟纖維化的研究報(bào)道稱(chēng)，在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化恢復(fù)過(guò)程中，通過(guò)α-SMA染色證實(shí)活化的HSC數(shù)量減少到原來(lái)的1/12左右；在急性肝損傷恢復(fù)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)HSC凋亡與HSC數(shù)量的減少相平行，進(jìn)一步表明凋亡對(duì)活化的HSC數(shù)量有調(diào)節(jié)作用[9]；具體原因還有待驗(yàn)證。Western blot結(jié)果顯示，TNF-α作用的BMEC中只有24 h 10 ng/mL劑量組檢測(cè)到α-SMA蛋白的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在TNF-α的作用下BMEC有向MFB轉(zhuǎn)分化的可能。

目前，已有在奶牛乳腺炎患牛乳汁及外周血中檢測(cè)到TNF-α高表達(dá)的報(bào)道[10]。表明在奶牛乳腺炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TNF-α的作用不容忽視；由于奶牛乳腺纖維化是奶牛乳腺炎發(fā)病過(guò)程中重要的病理表現(xiàn)，所以對(duì)奶牛乳腺纖維化發(fā)病機(jī)理的深入系統(tǒng)研究可以為乳腺炎的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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