馮松凱，李苗云，徐 超，張 勤，苗 麗，李 珂，楊 娜，劉勝男，呂曉飛

（1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南鄭州 450002；2.河南出入境檢驗檢疫局，河南鄭州 450003；3.三門峽出入境檢驗檢疫局，河南三門峽 472000）

近年來，我國已經(jīng)成為世界上最大的皮毛進口國，進口皮張來源廣泛。由于動物皮毛是細菌的良好培養(yǎng)基，其攜帶致病菌的風險越來越引起人們的關注。入境皮毛中攜帶的致病菌主要為布氏桿菌（Brucella）、大腸桿菌O157（E.coliO157）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乙型溶血性鏈球菌（β-streptococcus）、 丹 毒 桿 菌 （Erysipelothrix rhusiopathiae）、銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等。其中Brucella、E.coliO157和S.aureus等感染人的事件已有報道[1-3]。目前，國內(nèi)外對皮毛攜帶致病菌的檢測方法研究較少，而主要依靠經(jīng)典的細菌學鑒定和PCR法[4-6]，缺少對皮毛攜帶致病菌的高通量檢測方法。因此，本研究選擇在細菌分類鑒定學上具有重要生物學意義的16S rDNA基因和gyrB基因進行序列分析并設計兩對通用引物和相應的多條細菌鑒別探針，研究同時檢測6種致病菌的基因芯片檢測方法，并進行臨床應用效果評價。

1 材料和方法

1.1 菌 株B rucella、S.aureus26003-5a7株、β-streptococcus32210-4a株、E.rhusiopathiaeCVCC123、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）CVCC2002和B.cereusCVCC2003均購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；P.aeruginosaATCC15442和P.aeruginosaATCC10145由山東出入境檢驗檢疫局惠贈；蘇云金桿菌（B.thuringiensis）S1株和B.thuringiensisS6株由中國軍事醫(yī)學科學院微生物傳染病所惠贈；E.coliO157 NCTC 12900、S.aureusATCC29213、E.coliO152、李斯特桿菌（Listeria）、沙門氏菌（Salmonella）和阪崎腸桿菌（E.sakazakii）均由本實驗室鑒定保存。

1.2 主要試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京明日百傲生物科技發(fā)展研究所；MasterM ixTaq酶、100 bp DNA Marker均購自天跟生化科技有限公司；晶芯R基因芯片點樣液、光學級氨基基片購自博奧生物有限公司；SYBRRPremix ExTaqTM試劑盒購自TaKaRa公司；Smart ArrayerTM48芯片點樣儀、BioM ixerTMⅡ芯片雜交儀、晶芯SlideWasher芯片洗干儀、晶芯LuxScanIM 10K芯片掃描儀為博奧生物有限公司產(chǎn)品；LabCycler Standard梯度PCR儀為SENSO公司產(chǎn)品。

1.3 探針和引物的設計與合成 選擇細菌的16S rDNA基因和gyrB基因為靶基因，分別設計通用引物和每種致病菌的特異性寡核苷酸探針。上游引物5'端均標記TAMARA熒光基團，探針堿基長度小于35 bp的探針5'端加T至35 bp（表1和表2）。

表1 基因芯片檢測引物序列Table 1 The sequence of primers

表2 基因芯片檢測探針序列Table 2 The sequence of probes

1.4 細菌DNA的提取 無菌采集進境動物皮毛，接種LB液體培養(yǎng)基進行富集。取菌液8 000 r/m in離心5m in，采用細菌核酸提取試劑盒提取其DNA。同時，提取參考菌株DNA備用。

1.5 基因芯片檢測方法的建立和優(yōu)化

1.5.1 基因芯片的制備以晶芯R基因芯片點樣液稀釋各探針至終濃度30μmol/L，將各探針陣列點樣于空白基片。每張基片設12個矩陣，每個矩陣為18×10陣列（圖1）。點樣完畢，將制備的芯片80℃固定探針2 h～3 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 不對稱PCR方法的建立采用S.aureus、E.rhusiopathiae、Brucella、β-streptococcus、E.coliO157、P.aeruginosa6種致病菌基因組DNA，并以其為模板建立基于16S rDNA基因的不對稱PCR方法，優(yōu)化退火溫度為57℃；同時，以E.coliO157和P.aeruginosa基因組DNA為模板，建立基于gyrB基因的不對稱PCR方法，優(yōu)化退火溫度為55℃。兩種方法不對稱PCR反應體系為：2×TaqPCR MasterM ix 12.5μL，上游引物（20μmol/L）5.0μL，下游引物（20μmol/L）0.5μL，模板2.0μL，補ddH2O至25.0μL；不對稱PCR反應條件為：94℃ 5 Min；94℃ 1m in、57℃或55℃ 1 Min、72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃10m in。

圖1 基因芯片檢測探針布局Fig.1 The position of detection probes for DNA chip

1.5.3 基因芯片的雜交與洗滌取8μL 42℃預熱的雜交液a（47%甲酰胺、7×SSC、0.4%SDS、9×Denbardt's）與7μL PCR產(chǎn)物混勻，95℃變性10m in，迅速冰浴5 Min。參照晶芯R基因芯片雜交盒說明，將雜交樣品點加到基因芯片每個陣列中。芯片雜交儀中42℃、5 r/m in搖轉(zhuǎn)雜交4 h。以洗液Ⅰ（2×SSC、0.2%SDS）42℃振蕩洗滌3 min，重復3次；洗液Ⅱ（0.2×SSC）洗滌3次；超純水清洗2次后，300 r/m in離心甩干后備檢。

1.5.4 基因芯片掃描與分析預熱芯片掃描儀，選擇Cy3通道掃描雜交的基因芯片，LuxCan3.0軟件記錄、分析熒光信號強度。

1.5.5 基因芯片雜交條件的優(yōu)化選擇不同甲酰胺濃度的4種雜交液，參照1.5.3方法以致病菌PCR產(chǎn)物與制備的基因芯片分別30 Min、1 h、2 h、4 h雜交過夜，掃描、記錄雜交信號，根據(jù)雜交信號的強度選擇最佳雜交條件。雜交液配方為：雜交液a、b（3×SSC、0.2%SDS、25%甲酰胺、5×Denhardt's）、c（5×SSC、2.5%甲酸胺、0.2%SDS）和 d（20×SSC 1.5μL，10%SDS 0.25μL）。

1.6 特異性試驗 用溶液型細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取12種致病菌核酸，采用不對稱PCR方法對其進行擴增，與制備基因芯片雜交。

1.7 敏感性試驗 分別測定S.aureus、E.rhusiopathiae、Brucella、β-streptococcus、E.coliO157、P.aeruginosa6種致病菌核酸濃度，用ddH2O 10倍梯度稀釋，共做6個稀釋度，進行不對稱PCR擴增，與制備的基因芯片雜交進行敏感性檢測。

1.8 保存期試驗 以S.aureus、E.rhusiopathiae和BrucellaPCR產(chǎn)物分別與4℃避光1個月、2個月、4個月、6個月的基因芯片雜交進行基因芯片的穩(wěn)定性檢測。

1.9 方法比較 隨機選取163個送檢的皮毛樣品，分別稱取2 g，無菌剪碎后，加入5 ML LB培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)2 h～6 h。將菌液8 000 r/m in離心5 min沉淀菌體，提取核酸，進行芯片雜交。同時參照文獻[7]中PCR方法進行Brucella的鑒定及文獻[8]中熒光定量PCR方法進行S.aureus的鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 不對稱PCR擴增結(jié)果 采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明S.aureus、E.rhusiopathiae、Brucella、β-streptococcus、E.coliO157、P.aeruginosa6種致病菌均擴增出約1.4 kb的目的條帶；而采用gyrB基因通用引物對E.coliO157和P.aeruginosa核酸進行PCR擴增，均擴增出約2.0 kb的目的條帶，與預期片段相符。

2.2 基因芯片雜交條件優(yōu)化結(jié)果 分別選擇4種不同的雜交液和不同的雜交時間，參照1.5.3方法以S.aureusPCR產(chǎn)物與制備的基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號的強度，結(jié)果顯示：選擇雜交液a，在42℃、5 r/m in條件下雜交4 h雜交信號最強。

2.3 特異性試驗 以提取的12種致病菌核酸為模板，PCR擴增后，每種致病菌的擴增產(chǎn)物分別與制備基因芯片雜交。結(jié)果顯示擴增的Brucella、E.coliO157、S.aureus、β-streptococcus、E.rhusiopathiae、P.aeruginosa產(chǎn)物在相應檢測探針位點出現(xiàn)綠色熒光信 號 ， 擴 增 的B.cereus、E.coliO152、Listeria、Salmonella、E.sakazakii、B.thuringiensis產(chǎn)物 與基 因芯片雜交未出現(xiàn)信號（表3）。表明各致病菌探針間無交叉反應，制備的基因芯片具有很強的特異性。

表3 基因芯片特異性檢測結(jié)果Table 3 The specific result of DNA chip

2.4 敏感性試驗 分別提取Brucella、E.coliO157、S.aureus、β-streptococcus、E.rhusiopathiae、P.aeruginosa的基因組DNA，以10倍梯度稀釋，共做6個稀釋度，進行PCR擴增后與基因芯片進行雜交。結(jié)果表明：基因芯片可檢測到Brucella、E.coliO157、S.aureus、β-streptococcus、E.rhusiopathiae、P.aeruginosa陽性雜交信號核酸最低濃度分別約為10拷貝、10拷貝、100拷貝、100拷貝、10拷貝、100拷貝。

2.5 保存期試驗 與4℃避光保存的基因芯片進行雜交，結(jié)果顯示3種細菌的PCR產(chǎn)物與保存至少6個月的基因芯片雜交仍能出現(xiàn)陽性信號。此外，將制備的芯片在室溫條件下避光保存3、5和6個月，檢測結(jié)果顯示芯片仍具有很強的熒光信號。

2.6 方法比較結(jié)果 對選取的163張皮毛樣品進行基因芯片雜交，樣品1號和23號檢測結(jié)果為Brucella陽性（圖2），同時以Brucella引物進行PCR方法對皮毛進行檢測，結(jié)果1號和23號樣品均擴增出單一目的條帶（圖3）。樣品32號芯片檢測結(jié)果為S.aureus陽性（圖 2）。采用S.aureus實時熒光定量PCR方法對樣品32號進行檢測，可擴增出特異性目的曲線（圖4），與PCR鑒定結(jié)果一致。對163份皮毛樣品檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果符合率為100%。

圖2 基因芯片對皮毛樣品檢測結(jié)果Fig.2 Fur sample test results by DNA chip

圖3 Brucella引物對1號和23號皮毛樣品PCR檢測結(jié)果Fig.3 The PCR detections of fur sample No.1 and No.23 w ith Brucella specific primer

圖4 S.aureus引物對32號皮毛樣品熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.4 The fluorescence quantitative PCR curve of fur sample No.32 with S.aureus specific primer

3 討 論

目前，對皮毛中攜帶致病菌檢測依然使用傳統(tǒng)的方法，難以實現(xiàn)高通量檢測以及對攜帶的致病菌的快速篩選。本研究采用熒光標記設計的兩對通用引物，采用新的不對稱PCR技術，擴增后產(chǎn)生大量單鏈標記核酸片段，在此基礎上建立皮毛中6種致病菌的基因芯片檢測技術。該方法特異性強，靈敏度高，可以實現(xiàn)高通量快速檢測，適合現(xiàn)代進出境檢驗檢疫部門批量樣品檢測的需求。

影響基因芯片檢測技術關鍵因素之一是探針的設計和選擇。特異性寡核苷酸探針片段在致病菌核酸中的位置、探針的長度以及Tm值均影響芯片檢測的特異性、敏感性和雜交信號的強度[9-10]。本研究在設計探針時，充分考慮了寡核苷酸探針的Tm值，以保證在同一雜交溫度下基因芯片對樣品進行高通量檢測。同時，考慮到探針在芯片上的空間占位效應，研究將設計探針長度短于35 bp的在其5'端增加T堿基至35 bp。試驗結(jié)果表明，該方法設計的探針特異性好，熒光信號強于未加T堿基的其它探針。在基因芯片雜交過程中，雜交液中甲酰胺濃度、雜交溫度以及雜交時間共同影響著基因芯片雜交的特異性和敏感性。不適當?shù)碾s交條件影響芯片雜交信號的強度，甚至出現(xiàn)假陽性雜交信號[11]。本研究選擇4種不同濃度甲酰胺雜交液，同時對雜交溫度以及雜交時間進行優(yōu)化，最終確定基因芯片的最佳雜交條件，檢測最高靈敏度達到約10個基因拷貝數(shù)。

盡管基因芯片檢測技術因其高通量、微型化以及自動化等方面具有優(yōu)越性[12-14]，但是作為一種新技術還存在亟待解決的問題，如建立標準化程序、降低檢測費用以及進一步提高檢測的特異性等。本研究建立的方法能夠有效的檢測動物皮毛中攜帶的6種致病菌，同時該項技術為環(huán)境以及其他臨床樣品中致病菌的污染和傳播檢測提供了技術平臺。

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