趙浩軍，陳 靜，韋海濤，劉曉冬，趙景義，徐發(fā)榮，余 琦，李棟梁，馬志軍，岳 雷，張小飛

（1.北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京 100107；2.唐山怡安生物工程有限公司，河北唐山 063020；3.中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071）

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種人獸共患傳染病。尚無(wú)有效治療方法，該病病死率幾乎是100%[1]。近年來(lái)，我國(guó)狂犬病的發(fā)病數(shù)呈上升趨勢(shì)[2]。許多動(dòng)物都可以感染及傳播該病，犬是我國(guó)人狂犬病的主要傳染來(lái)源[3]。因此，對(duì)動(dòng)物實(shí)施免疫接種是預(yù)防人狂犬病最好的辦法。目前，國(guó)內(nèi)獸用狂犬病疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗兩種。其中，弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)[4-5]；滅活疫苗則長(zhǎng)期依賴進(jìn)口。因此，為推進(jìn)獸用狂犬病滅活疫苗的國(guó)產(chǎn)化進(jìn)程，提升犬狂犬病防控能力，本研究對(duì)唐山怡安生物工程有限公司生產(chǎn)的獸用狂犬病滅活疫苗（CTN-1株）中試產(chǎn)品進(jìn)行了臨床效果評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 疫苗株及強(qiáng)毒株 CTN-1株由中國(guó)藥品生物制品檢定所建株和保存，已確認(rèn)為符合要求的狂犬病疫苗生產(chǎn)用病毒株[6-7]；街毒CNX8511株由唐山怡安生物工程有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)疫苗 5批獸用狂犬病滅活疫苗（CTN-1株）中試產(chǎn)品由唐山怡安生物工程有限公司提供，批號(hào) 為 VRV-2008006、 VRV-2008007、 VRV-2008008、VRV-2008009和VRV-2008010；犬、貓狂犬病滅活疫苗（商品名為寵必威）購(gòu)自英特威國(guó)際有限公司中國(guó)代理，批號(hào)A038b01。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 9800條3月齡以上農(nóng)村家養(yǎng)犬，選自北京懷柔、房山、昌平、密云、延慶5個(gè)縣區(qū)。

1.4 主要試劑 標(biāo)準(zhǔn)血清（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品），購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，效價(jià)為21.4 IU/mL；FITC標(biāo)記的抗RV的NP單克隆抗體（MAb）購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，批號(hào)200708。

1.5 安全性試驗(yàn) 將試驗(yàn)犬分為試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組分5個(gè)批次組，總計(jì)7組。批次組每組1 900條，陽(yáng)性對(duì)照組200條，陰性對(duì)照組100條。采用臀部肌肉注射免疫，每條犬免疫1次，劑量1 ML，陰性對(duì)照組注射等體積生理鹽水。逐日觀察至免疫后第15 d，記錄出現(xiàn)臨床不良反應(yīng)的犬?dāng)?shù)量；并于免疫后第21 d，每組各取5條犬進(jìn)行病理剖檢，用HE染色法檢查腦組織和注射部位皮膚、肌肉的病理?yè)p傷情況。

1.6 免疫中和抗體水平評(píng)價(jià)試驗(yàn) 免疫前每個(gè)批次組各采集200條，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組各采集100條；免后第 7 d、14 d、21 d、28 d、56 d、180 d、240 d、300 d、360 d、390 d，在RV中和抗體陰性群體中隨機(jī)采集，其中，批次組各采集40條，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組各采集20條。采集血液經(jīng)常規(guī)方法分離血清，56℃滅活30 min，參照《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》要求，用熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN）測(cè)定RV中和抗體效價(jià)。

1.7 攻毒保護(hù)性試驗(yàn) 免后第390 d，在3個(gè)批次組 （VRV-2008006、 VRV-2008008、 VRV-2008010）、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組各取10條犬，采血測(cè)定中和抗體效價(jià)。用RV街毒CNX8511株對(duì)犬進(jìn)行攻毒，逐日觀察至攻毒后第90 d，記錄死亡數(shù)，并迫殺存活犬；取死亡犬和處死犬腦組織進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 11.5軟件對(duì)檢測(cè)的血清中和抗體效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（p<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的安全性 試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均分別有個(gè)別試驗(yàn)犬出現(xiàn)一過(guò)性臨床癥狀或輕度不良反應(yīng)，主要現(xiàn)象多為食欲不振、注射部位輕微疼痛，但所有癥狀在免疫后1 d～2 d內(nèi)自行消失，未發(fā)生中度或重度不良反應(yīng)。病理剖檢試驗(yàn)犬無(wú)明顯異常變化，試驗(yàn)犬的腦組織和注射部位均無(wú)明顯病理性損傷。結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗對(duì)犬具有較好的安全性。

2.2 RV中和抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 疫苗免疫后的整體中和抗體消長(zhǎng)規(guī)律抽樣檢測(cè)結(jié)果顯示：免疫后第7 d，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照中和抗體效價(jià)分別為 8.68 IU/mL±7.74 IU/mL和6.96 IU/mL±6.22 IU/mL。免疫后第21 d，試驗(yàn)組中和抗體達(dá)到峰值，為27.86 IU/mL±18.82 IU/mL。免疫后第28 d，陽(yáng)性對(duì)照組犬中和抗體達(dá)到峰值，為27.65 IU/mL±18.88 IU/mL。免疫后第390 d，試驗(yàn)組犬和陽(yáng)性對(duì)照犬中和抗體效價(jià)分別為0.63 IU/mL±0.3 IU/mL和0.61 IU/mL±0.32 IU/mL。陰性對(duì)照犬，從免疫接種開(kāi)始至免疫后第390 d，RV中和抗體均為0 IU/mL（圖1）。同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組中和抗體效價(jià)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，p值均大于0.05，表明試驗(yàn)疫苗的免疫效果與陽(yáng)性對(duì)照疫苗相當(dāng)。

圖1 疫苗免疫后中和抗體消長(zhǎng)曲線Fig.1 Dynam ics curve of neutralizing antibody（NA）after immunization

2.2.2 疫苗免疫后中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率及群體保護(hù)率抽樣檢測(cè)結(jié)果顯示：免疫后第7 d，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為99.5%和95%，群體有效保護(hù)率分別為90%和85%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值分別為0.63和0.1（0.05）。免疫后第14 d，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組犬抗體均陽(yáng)轉(zhuǎn)，并獲得100%的群體有效保護(hù)。免疫后第330 d，試驗(yàn)組的群體有效保護(hù)率仍為100%，而陽(yáng)性對(duì)照組的群體有效保護(hù)率下降到90%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值為10.61（>x20.05=3.84，p<0.05）。免疫后第360 d，試驗(yàn)組的群體有效保護(hù)率開(kāi)始下降，為90.5%，而陽(yáng)性對(duì)照組群體有效保護(hù)僅為85%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值為0.15（0.05）。免疫后第390 d，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的群體有效保護(hù)率分別為83%和80%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值為0.001（0.05）（表1）。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)用疫苗免疫后第7 d、14 d、360 d、390 d中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率及群體保護(hù)率與對(duì)照組疫苗相當(dāng)，而免疫后第360 d的群體保護(hù)率高于對(duì)照疫苗組。

表1 免疫后試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組血清中和抗體陽(yáng)及群體有效保護(hù)情況Table 1 Seroconversion of neutralizing antibody（NA）and group protection to test group and positive control group after immunization

2.2.3 各批次疫苗免疫后中和抗體消長(zhǎng)規(guī)律抽樣檢測(cè)結(jié)果表明：5批疫苗免后第7 d，各組產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)在6.14 IU/mL±5.01 IU/mL～8.56 IU/mL±8.27 IU/mL之間；免疫后第 21 d，VRV-2008006、VRV-2008010組的中和抗體達(dá)到峰值，分別為23.8 IU/mL±17.55 IU/mL和 27.97 IU/mL±19.37 IU/mL；免疫后第 28 d，VRV-2008007、VRV-2008008和VRV-2008009組的中和抗體達(dá)到峰值，分別為22.23 IU/mL±20.28 IU/mL、26.68 IU/mL±12.96 IU/mL和 26.72 IU/mL±15.51 IU/mL；免疫后第 390 d，各組中和抗體效價(jià)在0.6 IU/mL±0.21 IU/mL～0.66 IU/mL±0.24 IU/mL之間（圖2）。同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的各批次組中和抗體效價(jià)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，p值均大于0.05，表明試驗(yàn)疫苗的免疫效果與對(duì)照組疫苗相當(dāng)。

2.3 攻毒保護(hù)效果 免疫后第390 d的試驗(yàn)犬經(jīng)RV街毒CNX8511株攻擊后，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組犬均100%存活；陰性對(duì)照組在攻毒后在15 d～23 d，出現(xiàn)煩躁、恐懼不安等癥狀，對(duì)聲音、光線之類的刺激變得異常敏感，并于攻毒后18 d～30 d，陸續(xù)100%死亡（表 2）。

解剖和病理檢測(cè)表明，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組犬的腦組織無(wú)明顯病理性變化；陰性對(duì)照組犬腦組織出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象等狂犬病典型病理變化，并檢測(cè)到狂犬病毒抗原和病毒包涵體（圖3）。

圖2 各批次疫苗免疫后中和抗體消長(zhǎng)曲線Fig.2 Dynam ic curve of neutralizing antibody after immunizing each bath of vaccination

表2 三批次疫苗免疫后的攻毒保護(hù)效果Table 2 Immunization protection for virus inoculation after immunizing three bathes of vaccine

圖3 陰性對(duì)照組死亡犬腦組織病理變化Fig.3 Pathological changes for brain tissue of death dogs in negative control

3 討 論

CTN-1株分離于我國(guó)山東省淄博市，屬基因I型，是我國(guó)自主開(kāi)發(fā)的狂犬病疫苗株[8-9]。石磊泰、俞永新等研究表明，CTN-1疫苗株與國(guó)內(nèi)多數(shù)街毒株的同源性較高，其G基因氨基酸與國(guó)內(nèi)分離株的同源性大多在92.4%～97.7%，高于我國(guó)另一疫苗株aG株及PV株、PM 1503株、Flury-LEP株和ERA株等國(guó)外疫苗株與國(guó)內(nèi)分離株的同源性[10]。表明CTN-1株更適合制備預(yù)防中國(guó)狂犬病的滅活疫苗。

本實(shí)驗(yàn)以FANV方法檢測(cè)RV中和抗體效價(jià)，并以0.5 IU/mL作為評(píng)價(jià)狂犬病免疫效果標(biāo)準(zhǔn)[11-12]，符合WHO、OIE等國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)中和抗體檢測(cè)評(píng)價(jià)表明，獸醫(yī)狂犬病滅活疫苗（CTN-1株）對(duì)犬具有較好的安全性，各批次疫苗的免疫效果穩(wěn)定。與寵必威免疫效力的比較分析表明，獸醫(yī)狂犬病滅活疫苗（CTN-1株）免疫犬后，中和抗體效價(jià)產(chǎn)生峰值的時(shí)間較早，衰減速度較慢；免疫后第390 d，可以使83%的試驗(yàn)犬獲得有效保護(hù)，達(dá)到有效保護(hù)的犬的攻毒保護(hù)率能為100%。試驗(yàn)結(jié)果與石磊泰、俞永新等的研究相吻合。

在疫苗整個(gè)臨床應(yīng)用研究中，受試犬在免疫1次后第7 d即可達(dá)到國(guó)際一般標(biāo)準(zhǔn)（70%）以上的群體有效保護(hù)率，達(dá)到控制狂犬病流行的目的。但由于我國(guó)是狂犬病流行區(qū)，動(dòng)物狂犬病免疫密度低，因此，為確?？袢∫呙绲拿庖咝Ч?，建議首次免疫后隔10 d～14 d進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。

目前，獸用狂犬病滅活疫苗（CTN-1株）已獲農(nóng)業(yè)部審批，成為國(guó)內(nèi)第一個(gè)上市的獸用狂犬病滅活疫苗。隨著國(guó)產(chǎn)獸用狂犬病滅活疫苗的推廣使用，將有利于降低動(dòng)物狂犬病防控成本，提高免疫密度，符合我國(guó)動(dòng)物狂犬病防控的實(shí)際需求和《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》關(guān)于動(dòng)物狂犬病防控的戰(zhàn)略要求。

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