李玉明，王 剛，汪志艷，劉永剛，涂亞斌，王淑杰，姜成剛，王延群，蔡雪輝*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物疫病診斷中心，黑龍江哈爾濱 150001）

細(xì)胞凋亡途徑包括內(nèi)源與外源兩種。內(nèi)源途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)部的某些誘導(dǎo)因素，包括DNA損傷、DNA復(fù)制錯(cuò)誤等引起的[1]。內(nèi)源性凋亡過(guò)程主要是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白（Bcl-2等）和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白（Bax等）之間的胞內(nèi)表達(dá)水平來(lái)完成的[2]。外源凋亡途徑也稱為死亡受體途徑，是外源的可溶性配體與細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合后促進(jìn)了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)的形成，這些配體包括腫瘤壞死因子（TNF）、Fas配體（FasL）等[3]。此外，除AIF依賴途徑外，內(nèi)、外源凋亡途徑最終均是通過(guò)活化狀態(tài)的caspase-3剪切胞內(nèi)底物，最終導(dǎo)致DNA降解及細(xì)胞核崩解[4]。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染可以引起豬肺、淋巴組織以及生殖器官中細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。PRRSV感染豬肺中的細(xì)胞凋亡與感染細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α密切相關(guān)[6-7]。此外，我國(guó) 2006年發(fā)現(xiàn)的PRRSV變異株可以誘導(dǎo)胸腺萎縮并引起胸腺內(nèi)細(xì)胞大量凋亡[8-10]，但凋亡誘導(dǎo)因素目前尚未可知。本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)豬凋亡相關(guān)因子 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3的方法，為進(jìn)一步研究PRRSV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路提供方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 PRRSV HuN4株由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存，病毒滴度為3×105.0TCID50/mL；8頭30日齡健康斷奶仔豬購(gòu)自哈爾濱周邊某豬場(chǎng)，經(jīng)PCR和ELISA檢測(cè)PRRSV抗原及抗體均為陰性，隔離飼養(yǎng)并觀察一周后開始試驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒純化試劑盒和RNeasy Plus Mini RNA提取試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司；禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、RNA酶抑制劑、rTaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶（Hot Start Version）購(gòu)自TaKaRa公司；RotorGene3000熒光定量PCR儀為Corbett公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的豬凋亡相關(guān) 因子 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及內(nèi)參β-actin的基因序列，應(yīng)用Oligo7軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR的特異性引物（表1），擴(kuò)增片段用于熒光定量陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒的構(gòu)建。PCR引物由Invitrogen生物科技有限公司合成。

1.4 豬凋亡相關(guān)因子及內(nèi)參β-actin重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將實(shí)驗(yàn)仔豬分為兩組，感染組和對(duì)照組分別接種 PRRSV HuN4 株（3×105.0TCID50/mL）和 PBS，接種途徑和劑量為肌肉注射1 ML、滴鼻2 ML。感染后第10 d迫殺，無(wú)菌采取仔豬胸腺組織，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，分別擴(kuò)增TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及β-actin片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后克隆至pMD18-T載體，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和序列分析驗(yàn)證為陽(yáng)性，測(cè)定DNA濃度后，以10倍系列稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品至下限達(dá)10拷貝/μL。

表1 SYBR Green IqRT-PCR擴(kuò)增用引物和反應(yīng)條件Table 1 Amplification conditions and Primers of the SYBR Green IqRT-PCR

1.5 反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化 在相同模板濃度與反應(yīng)體系中，采用矩陣法優(yōu)化引物最佳濃度；采用梯度PCR調(diào)整不同退火溫度（Tm），選擇最佳Tm值。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用10倍系列稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10拷貝/μL～108拷貝/μL為模板，經(jīng)熒光定量PCR儀檢測(cè)后，計(jì)算Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物，分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和SYBR Green I qRT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析和熔解曲線分析。

1.8 敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用上述優(yōu)化的PCR條件進(jìn)行特異性試驗(yàn)。分別取梯度稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green IqRT-PCR檢測(cè)，以確定該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別以10倍倍比稀釋的各標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行SYBR Green IqRT-PCR擴(kuò)增，各進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)和批間重復(fù)檢測(cè)，批間重復(fù)檢測(cè)每種樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，通過(guò)計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）評(píng)價(jià)其重復(fù)性。

1.10 樣品檢測(cè) 取感染組和對(duì)照組豬胸腺組織，提取組織總RNA，利用建立的方法檢測(cè) TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 的 mRNA拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果 分別擴(kuò)增TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及β-actin的目的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果表明，獲得大小分別約為200 bp、170 bp、130 bp、190 bp、160 bp、175 bp、165 bp和200 bp的片段，與預(yù)期相符（圖1）。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析，表明構(gòu)建了TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 及 β-actin重組質(zhì)粒。

圖1 凋亡細(xì)胞因子和β-actin PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of apoptotic cytokine genes and β-actin gene by PCR

2.2 SYBR Green I qRT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)SYBR Green IqRT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)引物濃度為10 pmol/μL，Tm為56℃時(shí)，可以獲得最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度。優(yōu)化后反應(yīng)體系：SYBR Green I qPCR Master Mix（2×）12.5μL；上、下游引物（10 pmol/μL）各 1μL；模板（質(zhì)?；騝DNA）1μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃ 30 s、52℃～60℃ 30 s、72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析為：60℃～95℃，每0.5℃讀板1次，1 s/次。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及 β-actin質(zhì)粒為模板，進(jìn)行SYBR Green IqRT-PCR擴(kuò)增并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.998（圖2）。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及β-actin基因模板進(jìn)行SYBR Green IPCR檢測(cè)。熔解曲線分析表明，各凋亡因子及β-actin均為特異性單峰（圖2）。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3及β-actin檢測(cè)下限均為10拷貝 /μL。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 以 104拷貝 /μL～106拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，采用建立的方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明，批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均小于3%，重復(fù)性良好（表2）。

表2 SYBR Green IqRT-PCR方法的批內(nèi)與批間重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Intra-assay and inter-assay reproducibility of SYBR Green IqRT-PCR

2.7 樣品檢測(cè)結(jié)果 采用建立的定量方法檢測(cè)PRRSV感染豬胸腺組織中 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示病毒感染后 10 d TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，Bax、Bcl-2表達(dá)水平也有所提高，但Bax/Bcl-2值變化不明顯（圖3）。

3 討論

許多病毒感染后也可以引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能是病毒在體內(nèi)擴(kuò)增所必需的，同時(shí)細(xì)胞凋亡也是機(jī)體應(yīng)對(duì)病毒感染的一種抗病毒機(jī)制，因此對(duì)凋亡細(xì)胞因子進(jìn)行快速檢測(cè)和準(zhǔn)確定量，將有助于研究病毒的致病機(jī)理及免疫機(jī)制。

qRT-PCR以其敏感、特異、污染少、可以定量等優(yōu)點(diǎn)成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中的主要方法。SYBRGreenⅠqPCR因其能監(jiān)測(cè)任何雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，不需設(shè)計(jì)探針，方法簡(jiǎn)便，成本低，在核酸檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。本研究根據(jù)豬源凋亡相關(guān)因子TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3 及內(nèi)參β-actin的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR擴(kuò)增目的基因片段，構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并繪制了SYBR Green IqRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，并且擴(kuò)增效率為100%～106%；敏感性高，檢出下限為101拷貝/μL；特異性強(qiáng)，SYBR Green IRT-PCR產(chǎn)物熔解曲線熔解峰單一，瓊脂糖凝膠電泳只有一條特異性條帶；重復(fù)性好，每種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以相同濃度作為起始模板時(shí)的Ct值相對(duì)固定，組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于3%。該方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)豬源凋亡因子TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3基因的表達(dá)水平。對(duì)PRRSV感染10 d后豬的胸腺組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明 PRRSV感染豬胸腺中 TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、caspase-3表達(dá)量顯著上調(diào)，但Bax/Bcl-2值變化不明顯，表明胸腺中細(xì)胞的凋亡主要是通過(guò)受體途徑而非線粒體途徑介導(dǎo)的。

本研究建立的豬源凋亡因子TNF-α、TNFR1、FasL、Fas、Bax、Bcl-2、caspase-3的檢測(cè)方法有助于研究病毒體外感染宿主細(xì)胞后的凋亡因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，也借助感染動(dòng)物模型研究感染PRRSV后宿主體內(nèi)的凋亡因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，為研究病毒感染豬后組織器官的凋亡情況提供方法。

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