劉 丹，劉建波，吳洪麗，王一平，危艷武，唐青海，李勝斌，魏 萍，劉長(zhǎng)明*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 1500301）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirses，PCVs）分為PCV1和PCV2兩種血清型,并在豬群中廣泛流行，但PCV1不引起臨床癥狀，而PCV2被證明是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原[1]。PCV2還與豬皮炎與腎炎綜合征（PDNS）、母豬繁殖障礙及增生性壞死性肺炎（PNP）、呼吸道疾病綜合征（PRDC）、肉芽腫性腸炎和間質(zhì)性肺炎等疾病有關(guān)[2-4]，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）[1]。PCV2能夠破壞豬體免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，誘發(fā)多種病原混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致難以控制的嚴(yán)重疾病[1]。

PCVs基因組由單股負(fù)鏈閉合環(huán)狀DNA構(gòu)成，其中 PCV1含 1 759 nt， PCV2含 1 766 nt～1 768 nt，由2個(gè)大的反義開放閱讀框架（ORF1和ORF2），其中ORF1編碼Rep蛋白參與病毒的復(fù)制，是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼的Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白[5]。PCV1與PCV2之間具有低水平的抗原交叉反應(yīng)，主要與Rep蛋白同源性高有關(guān)[5-6]。PCV2-Rep基因?yàn)?45 nt，編碼314個(gè)氨基酸（aa），分子量為36 ku，預(yù)測(cè)有3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。在病毒復(fù)制中PCV2-ORF1轉(zhuǎn)錄本mRNA第417 nt～799 nt處發(fā)生剪接，產(chǎn)生截短的Rep'蛋白，由178個(gè)aa組成，分子量為20.4 ku。剪接過程中Rep'蛋白C-末端閱讀框移位，導(dǎo)致了Rep'與Rep蛋白第140位后C末端氨基酸序列完全不同[7]。研究表明，Rep和Rep'的結(jié)合位點(diǎn)位于ORF1與ORF2間莖-環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)，兩者為病毒復(fù)制必須的[5]。有關(guān)PCV2-Rep'抗原表位的研究還未見報(bào)道[8]。本研究利用桿狀病毒表達(dá)的PCV2-rRep'蛋白免疫鼠制備MAb，并利用MAb對(duì)PCV2-Rep'抗原表位進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步開展該病毒分子生物學(xué)及診斷技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞及動(dòng)物 弗氏佐劑、HAT、HT混合鹽及兔抗鼠酶標(biāo)IgG（HRP-IgG）均購(gòu)自Sigma公司；ABTS購(gòu)自BBI公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；Mouse MonoAb-ID Kit（HRP）和Ni-NTA親和層析試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。6～8周齡雌性BALB/c鼠由本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 重組桿狀病毒表達(dá)PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白的毒株構(gòu)建及鑒定見文獻(xiàn)[9]，按照Ni-NTA親和層析試劑盒操作說明書方法純化重組蛋白。以SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳分析，紫外法凝膠掃描確定蛋白純度。

1.3 動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合 將純化的重組PCV2-rRep'蛋白與弗氏佐劑乳化制備免疫原，免疫小鼠程序按文獻(xiàn)[10]。將重組桿狀病毒表達(dá)純化的PCV2-rRep'蛋白作為檢測(cè)抗原，以間接ELISA法用于MAb陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株篩選，操作程序參考文獻(xiàn)[10]，P/N≥2.1判為陽(yáng)性，免疫鼠血清抗體效價(jià)達(dá)1∶10 000以上用于細(xì)胞融合。細(xì)胞融合參考文獻(xiàn)[10]，以50%的聚乙二醇（PEG 1450）溶液對(duì)骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）與免疫鼠脾細(xì)胞按1∶5比例進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)篩選呈陽(yáng)性反應(yīng)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行3次克隆純化。

1.4 MAb亞類鑒定 按照Mouse MonoAb-ID Kit（HRP）試劑盒對(duì)MAb亞類進(jìn)行鑒定，操作按說明書方法進(jìn)行；腹水制備參考文獻(xiàn)[10]的方法。

1.5 MAb免疫活性鑒定 用重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白，以野生型桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物和健康Sf-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，對(duì)制備的MAb進(jìn)行western blot鑒定，操作程序參考文獻(xiàn)[10]。

1.6 MAb抗原交叉反應(yīng)鑒定 按文獻(xiàn)[11]方法制備IPMA反應(yīng)板，設(shè)PCV1與PCV2接種孔及未接種病毒對(duì)照孔，用MAb細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行PCV1和PCV2抗原交叉試驗(yàn)，光學(xué)顯微鏡觀察判定。

1.7 肽掃描法抗原識(shí)別表位初步定位 根據(jù)GenBank中PCV2基因（HM 038034）序列，采用DNASTAR（Ver.7.2.1）軟件對(duì)PCV2-LG株編碼的Rep'蛋白基因（537 nt）推導(dǎo)出氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成覆蓋了該蛋白全部aa序列，以相互重疊6個(gè)aa的9個(gè)短肽，每段長(zhǎng)度均為25 aa（表1）。短肽合成由上海吉爾生化有限公司完成。以合成肽作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，包被濃度為20μg/mL，同設(shè)SP2/0上清作為陰性對(duì)照。

1.8 肽掃描法抗原識(shí)別表位精確定位 為更精確的確定抗原表位，將Rep'A-4片段對(duì)應(yīng)的氨基酸序列從N端和C端的兩側(cè)以2個(gè)aa殘基為單位順移直到C末端與N末端肽段重合為止，共合成9條短肽，每段長(zhǎng)度均為15 aa（表2）。將合成肽作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，包被濃度為20μg/mL，同設(shè)SP2/0上清為對(duì)照。

表1 根據(jù)PCV2-Rep'蛋白編碼氨基酸序列設(shè)計(jì)的合成多肽序列Table 1 Design of the synthesized peptide sequence overlapping PCV2-Rep'coding region

表2 覆蓋Rep'-4段區(qū)合成肽序列設(shè)計(jì)Table 2 Design of the synthesized peptide sequence overlapping the Rep'-4 region

2 結(jié) 果

2.1 MAb制備及篩選 以純化的PCV2-rRep'蛋白免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選到一株能夠分泌抗PCV2-Rep'蛋白的MAb陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為3D1株。該細(xì)胞株經(jīng)3次克隆純化，并連續(xù)傳10代，經(jīng)凍存與復(fù)蘇，表明分泌MAb能力穩(wěn)定。

2.2 MAb亞類與效價(jià)測(cè)定 對(duì)MAb亞類鑒定結(jié)果表明，3D1株 MAb屬于 IgG1，輕鏈為 κ；間接ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清抗體效價(jià)為1∶1 600，腹水效價(jià)為 1∶819 200。

2.3 MAb免疫活性鑒定 以3D1 MAb與重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白進(jìn)行western blot，試驗(yàn)結(jié)果顯示,這株MAb與rRep'和rRep重組蛋白在20.4 ku和36.0 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶（圖1），表明該株MAb具有良好的特異性和反應(yīng)原性。

圖1 3D1 MAb的western blot免疫活性鑒定Fig.1 Identification of 3D1 MAb against PCV2-rRep protein by western blot

2.4 MAb特異性鑒定 用MAb對(duì)PCV2感染細(xì)胞中 Rep'蛋白抗原進(jìn)行了IPMA檢測(cè)（圖2）。MAb與PCV2感染陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)呈棕紅色（2A），與PCV2陽(yáng)性血清反應(yīng)情況相似（2B），健康對(duì)照細(xì)胞無著色反應(yīng)（2C）。結(jié)果表明，該單抗能夠與PCV2感染細(xì)胞中Rep'蛋白抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)。同設(shè)另一組試驗(yàn)是用該MAb與PCV1-G株感染細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果為陰性，證明3D1株MAb僅與PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)，而與PCV1無交叉反應(yīng)，結(jié)果未顯示。

圖2 用MAb對(duì)PCV2感染細(xì)胞中Rep'抗原的IPMA鑒定Fig.2 Identification of the Rep'antigen in in PCV2-infected cells by IPMA using MAb

2.5 抗原識(shí)別表位的初步定位 為了確定該MAb針對(duì)的PCV2-Rep'蛋白抗原表位，以MAb培養(yǎng)上清與合成的9段多肽進(jìn)行ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，這株單抗僅與Rep'A-4肽段抗原產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，與其它肽段呈陰性，表明MAb對(duì)應(yīng)的抗原表位位于Rep'A-4片段。

2.6 抗原識(shí)別表位的精確定位 根據(jù)Rep'A-4片段25個(gè)aa序列，再設(shè)計(jì)合成9條短肽，即Rep'A-4-1～9，各肽段間相差2個(gè)aa，以此合成肽作為包被抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。這株MAb可與Rep'A-4-1、Rep'A-4-8、Rep'A-4-9肽段產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，與其他肽段呈陰性，表明該MAb的抗原識(shí)別表位由13個(gè)aa組成，確定核心序列為61FAN-

圖3 用3D1株MAb對(duì)PCV2-Rep'抗原識(shí)別表位的初步定位Fig.3 Mapping of PCV2-Rep'recognition epitope w ith 25 peptide by ELISA

圖4 3D1Mab對(duì)PCV2-Rep'抗原識(shí)別表位的精確定位Fig.4 Finemapping of PCV2-Rep'antigen recognition epitopes

3 討論

隨著PCV2滅活疫苗的廣泛應(yīng)用，使該病流行得到有效控制，但由此也產(chǎn)生了疫苗免疫與自然野毒感染間鑒別診斷的問題。因此，建立一種檢測(cè)抗PCV2非結(jié)構(gòu)Rep'和Rep蛋白抗體方法，與本實(shí)驗(yàn)室建立檢測(cè)PCV2-Cap蛋白抗體的方法相結(jié)合[12]，可以用于PCV2滅活疫苗及Cap亞單位疫苗免疫與自然野毒感染動(dòng)物之間的血清學(xué)鑒別診斷。

利用桿狀病毒表達(dá)的PCV2-Rep'蛋白作為免疫原制備MAb，具有抗原制備較全病毒容易，且純度高，免疫原性好等優(yōu)勢(shì)[10]。在MAb篩選中使用了野生型桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物和正常昆蟲細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行平行檢測(cè)，排除了非特異性。通過western-blot顯示，制備的MAb不僅可以識(shí)別重組桿狀病毒表達(dá)的剪切Rep'蛋白，也可與重組桿狀病毒表達(dá)的全長(zhǎng)Rep蛋白產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。抗原表位鑒定結(jié)果表明，其對(duì)應(yīng)的核心序列為61FANFVKKQTFNKV73，該區(qū)域與Rep蛋白N端編碼區(qū)相同，屬于Rep'和Rep蛋白共有的同一線性抗原表位。Tao等利用MAb鑒定出PCV2-Rep蛋白2個(gè)線性抗原表位aa 39～aa 46和aa 99～aa 106[13]，與本研究鑒定的抗原表位不同，該表位屬于為首次鑒定。由于PCV1與PCV2在ORF1編碼序列同源性高達(dá)83%，存在一定抗原交叉反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)以PCV1-G株、NMB株、Jiang su株、Tianjin株編碼的PCV1-Rep蛋白的序列（58FANFAKKQTFNKV70）對(duì)比顯示，與本研究鑒定的表位核心區(qū)僅差一個(gè)氨基酸殘基（PCV2∶65V/PCV1∶62A）。3D1 MAb僅與PCV2發(fā)生反應(yīng)，而與PCV1無交叉反應(yīng)，表明該單抗適用于PCV2-Cap亞單位疫苗免疫與自然野毒感染動(dòng)物間鑒別診斷的目的。

對(duì)該病毒復(fù)制機(jī)理表明，Rep'和Rep是病毒復(fù)制所必須的，它們共同參與了啟動(dòng)復(fù)制[14-15]。鑒于Rep'和Rep蛋白在轉(zhuǎn)錄剪切過程中C末端發(fā)生閱讀框移位，導(dǎo)致了二者抗原性與作用機(jī)理可能存在很大不同。因此，該MAb為今后深入開展病毒復(fù)制機(jī)理研究提供了條件。

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