牛思博，姜志剛，德艷艷，于 力

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/大動物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella mutocida）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬中具有異質性特征的病原菌群，根據(jù)菌體表面的莢膜多糖的抗原特異性將該菌分為A、B、D、E和F 5個莢膜型[1]。該菌為條件致病菌，主要引起家養(yǎng)和野生動物以敗血及呼吸系統(tǒng)疾患為主要特征的疾病[2]。每個莢膜型的宿主嗜性、致病特點都不盡相同，不同莢膜血清型之間的交叉保護性較差。

莢膜A型多殺性巴氏桿菌主要侵害肉牛及奶牛的呼吸系統(tǒng)，以牛的巴氏桿菌肺炎為特征。該病呈散發(fā)或地方性流行，2006年以來對我國養(yǎng)牛業(yè)的危害極其嚴重[1,3]。2008年本實驗室在國內首次報道分離出牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌，至2012年，該病在我國至少有10個省區(qū)發(fā)生與流行[4]。由于以往我國主要流行由莢膜B型多殺性巴氏桿菌引起的牛出血性敗血癥，而牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌肺炎作為一種新發(fā)疫情，亟待研究有效的疫苗進行防控。

脂蛋白E（PlpE）是巴氏桿菌的一種膜脂蛋白，具粘附宿主細胞的作用。研究表明，溶血性曼氏桿菌（M.haemolytica）的PlpE在牛體內可誘導較高滴度的抗體[5]，經(jīng)大腸桿菌表達的重組PlpE（rPlpE）與商品化溶血性曼氏桿菌疫苗聯(lián)合免疫小鼠可提升該疫苗的免疫保護力[5-6]。由此推測，多殺性巴氏桿菌的PlpE也是一種保護性抗原。

本研究將牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌PM-HLJ株的PlpE進行原核表達，并將重組蛋白免疫小鼠進行免疫原性評價，以確定多殺性巴氏桿菌PlpE的免疫保護性，為開發(fā)安全有效的莢膜A型多殺性巴氏桿菌新型疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株，質粒載體及實驗動物 牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌PM-HLJ株由本實驗室分離鑒定并保存。感受態(tài)細胞DH5α和pMD18-T載體購自TaKaRa公司，BL21（DE3）購自天根生化科技有限公司，pET-30a（+）載體為本實驗室保存。6周齡雌性BALB/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶及各種限制性內切酶均購自TaKaRa公司，T4 DNA連接酶購自NEB公司，IPTG和HRP標記的His（HRP-IgG）單克隆抗體（MAb）以及兔抗鼠IgG（HRP-IgG）均購自Sigma公司，Ni-NTA瓊脂糖填料購自QIAGEN公司。

1.3 引物的設計及合成 根據(jù)GenBank中登錄的莢膜A型多殺性巴氏桿菌PlpE基因序列（EF219455）設計一對測序引物：Seq-F：5'-ATGAAACAAATCG TTTTAAAAAC-3'，Seq-R：5'-TTATTGTGCTTGGTG ACTTTTTTCAGC-3'；及一對表達引物Exp-F：5'-C GGAATTCATGAAACAAATCGTTTTAAAAAC-3'（EcoRⅠ），Exp-R：5'-GCGTCGACTTATTGTGCTTG GTGACTTTTTTCAGC-3'（SalⅠ）。

1.4 基因克隆與序列測定 采用煮沸法提取莢膜A型多殺性巴氏桿菌PM-HLJ株的基因組DNA作為PCR模板，用測序引物對PlpE基因進行PCR擴增。反應條件為94℃5 s；94℃40 s、60℃45 s、72℃60 s，共30個循環(huán)；72℃10 Min?；厥諗U增產(chǎn)物，將其克隆于pMD18-T載體中，重組質粒由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.5 重組蛋白的表達和提純 將用表達引物擴增產(chǎn)物克隆入表達載體pET-30a（+），轉化大腸桿菌BL21（DE3）。提取重組質粒，雙酶切鑒定，序列測定驗證閱讀框是否正確及有無突變出現(xiàn)。

將重組質粒轉化大腸桿菌BL（DE3），接種含卡納霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600nm值為0.6，以終濃度為0.2 mmol/L的IPTG于16℃誘導表達16 h，將培養(yǎng)物離心后進行超聲破碎，離心收集上清用于鑒定可溶性蛋白的表達效果。按Ni-NTA瓊脂糖純化系統(tǒng)的使用說明書純化目的蛋白，并使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白的濃度。

1.6 rPlpE的SDS-PAGE檢測和western blot鑒定通過SDS-PAGE電泳對rPlpE的表達與純化進行檢測。分別以His（HRP-IgG）MAb（1∶2 500）和 PM-HLJ小鼠多克隆抗血清（1∶100）為一抗，以兔抗鼠IgG（HRP-IgG）二抗，通過底物DAB顯色，進行重組蛋白的western blot鑒定。

1.7 莢膜A型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗的制備PM-HLJ菌種以2%體積接種于BHI液體培養(yǎng)基中，于37℃、75 r/m in培養(yǎng)16 h，經(jīng)菌落計數(shù)后，以0.2%甲醛溶液，于37℃滅活24 h，將滅活培養(yǎng)物接種BHI平板培養(yǎng)基進行滅活檢驗后，與15%體積的法國佐劑（MONTANIDE ISA 15A VG）充分混合，制備滅活疫苗。

1.8 小鼠免疫保護試驗 將40只BALB/c小鼠隨機分成8組（A-H），每組5只，采用腹腔途徑免疫乳化后的rPlpE（15%體積的法國佐劑）。A-E組rPlpE的免疫劑量分別為5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、60μg，G組免疫PM-HLJ滅活疫苗，劑量為1×107cfu，H注射PBS作為空白對照組。首次免疫后14 d進行二次免疫。采集一免前、一免后14 d和二免后14 d小鼠尾靜脈血并分離血清，包被rPlpE，通過間接ELISA檢測免疫小鼠血清中針對重組蛋白IgG的產(chǎn)生動態(tài)。于二免后21 d經(jīng)腹腔注射PM-HLJ活菌（30 cfu）進行攻毒。記錄小鼠死亡數(shù)和免疫保護率。

2 結 果

2.1 PM-HLJ株PlpE基因的克隆及測序 PCR擴增獲得到預期大小約為1100 bp的PlpE基因片段（圖1）。序列分析顯示，PM-HLJ株PlpE基因編碼的氨基酸序列與莢膜A型多殺性巴氏桿菌P-1059株（EF219455）PlpE的序列一致性高達95.83%。

圖1 PlpE基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of PlpE gene

2.2 rPlpE的表達與鑒定 重組菌株經(jīng)IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE檢測，結果顯示，重組蛋白分子量約為45 ku，與預期大小相符，重組蛋白以可溶形式表達。目的蛋白采用鎳離子親和層析純化。以His MAb以及小鼠全菌體多抗分別作為一抗對純化的rPlpE蛋白進行western blot鑒定。結果顯示，在45 ku處分別出現(xiàn)明顯的免疫特異性反應條帶，表明重組蛋白與His MAb以及小鼠多抗均具有良好的反應原性（圖2）。

2.3 免疫小鼠針對rPlpE的IgG抗體檢測 間接ELISA結果顯示（圖3），各免疫組小鼠在一次免疫后均產(chǎn)生了針對重組蛋白的IgG抗體，二次免疫后抗體水平均明顯升高。5μg和10μg rPlpE免疫組產(chǎn)生了低水平的IgG抗體，而60μg rPlpE免疫組和滅活苗免疫組的抗體水平最高，OD450nm值可達到1.5。

2.4 rPlpE蛋白的免疫保護性 二免后21 d小鼠腹腔途徑注射3MLD（30 cfu）的PM-HLJ活菌，結果顯示，接種5μg、10μg rPlpE免疫組的小鼠未產(chǎn)生對PM-HLJ攻擊的保護力，20μg、30μg和40μg免疫組對小鼠保護率分別為20%、40%和80%，60μg免疫組小鼠可以完全抵抗PM-HLJ的攻擊。全菌體滅活疫苗對照組可以完全抵抗PM-HLJ的攻擊（表1）。結果表明，牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌的rPlpE對小鼠具有免疫保護效力。

圖2 rPlpE蛋白的SDS-PAGE（A）及western blot（B）分析Fig.2 SDS-PAGE and western blot analysis of expressed rPlpE

圖3 間接ELISA檢測小鼠血清中抗rPlpE IgG抗體Fig.3 Detection of IgG antibodies against rPlpE in sera ofm ice by indirect ELISA

表1 rPlpE免疫小鼠對PM-HLJ攻擊的保護作用Table 1 Protection of themice inoculated w ith recombinant PlpE against PM-HLJ challenge

3 討 論

Pandher等報道，胸膜肺炎放線桿菌的外膜脂蛋白A（Om lA）與溶血性曼氏桿菌的PlpE氨基酸序列同源性僅為18%，但均為保護性抗原[7]。莢膜A型多殺性巴氏桿菌與溶血性曼氏桿菌，胸膜肺炎放線桿菌均屬于巴氏桿菌科[8]，而已發(fā)表全基因組序列的莢膜A型多殺性巴氏桿菌pm-70株的PlpE與溶血性曼氏桿菌PlpE的同源性為24.3%。因此推測，莢膜A型多殺性巴氏桿菌的PlpE也為保護性抗原。本研究結果也顯示，免疫60μg rPlpE可使小鼠完全抵抗30 cfu（3MLD）PM-HLJ的攻擊，與滅活PM-HLJ（5×107cfu）對照組的保護率同為100%。表明牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌的PlpE具有免疫保護效力。

目前，多殺性巴氏桿菌PlpE作為一種免疫保護性抗原，其免疫原性與蛋白結構的相關性尚不清楚。研究表明，溶血性曼氏桿菌PlpE和放線桿菌Om lA具有獨特的共同結構，PlpE和Om lA在多肽鏈的氨基端存在一連串的絲氨酸和甘氨酸殘基，推測這一獨特結構與PlpE和Om lA的免疫保護性相關[11]。然而，多殺性巴氏桿菌PlpE的氨基端不具有上述兩種蛋白的特殊結構[8]。因此推測溶血性曼氏桿菌PlpE和放線桿菌Om lA的免疫保護性機制不適用于多殺性巴氏桿菌PlpE。Singh等預測，PlpE多肽鏈的疏水區(qū)可能具有抗原性[9]。然而，由于多殺性巴氏桿菌菌體蛋白復雜，并且缺乏有效的提取、鑒定以及晶體結構解析單一菌體膜蛋白的方法，因此還不能對此假設進行驗證。

目前，牛巴氏桿菌肺炎防控技術的研究主要針對莢膜A型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗和減毒活疫苗。全菌體滅活疫苗具有明顯的血清型和莢膜型特異性，并且由于大量無關抗原的存在，導致機體產(chǎn)生不良反應。弱毒疫苗雖能提供一定程度的同源和異源保護，但存在毒力返強等安全隱患[10]。亞單位疫苗作為一種新型疫苗，與傳統(tǒng)全菌體滅活疫苗和減毒活疫苗相比具有安全性高、純度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。本研究表明，PM-HLJ的rPlpE針對同種莢膜型多殺性巴氏桿菌具有免疫保護性，可以作為莢膜A型多殺性巴氏桿菌的免疫原。進一步研究可通過rPlpE與多殺性巴氏桿菌滅活疫苗聯(lián)合免疫，以彌補單一免疫原rPlpE造成的免疫效力不足，同時減少滅活疫苗因大量無關抗原產(chǎn)生的副反應。

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