樸海燕，張益維，唐同同，劉 印，張羽汐

(東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 吉林 132012)

天然紅曲色素是目前世界上唯一利用微生物發(fā)酵所得的天然紅色，在我國已有千年多的應(yīng)用歷史[1]。隨著毒理學(xué)研究的深入發(fā)展，人們越來越追求綠色產(chǎn)品和天然產(chǎn)品，紅曲色素作為一種天然色素其安全性高，急慢性毒性實驗、致突變實驗都證明其無毒，也無致突變作用。由紅曲色素取代人工合成色素的前景廣闊，且紅曲色素也是我國食品法規(guī)定允許使用的食品色素之一，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種食品著色過程中[2]。

天然紅曲色素生產(chǎn)方法主要有固態(tài)法和液態(tài)法，其中液態(tài)法主要用于水溶性紅曲色素的生產(chǎn)。我國常用發(fā)酵法生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品品質(zhì)難以控制，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，不利于工業(yè)化大生產(chǎn)[3]。本研究期望獲得高產(chǎn)量紅色素，為確定最佳發(fā)酵條件對一些關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，如碳源、氮源、微量元素、pH值、搖瓶旋轉(zhuǎn)速度等。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種

紅曲霉菌株Monascus purpureus(ATCC 16365)，保存培養(yǎng)基成分為:20 g葡萄糖、3 g麥芽膏、5 g蛋白胨、3 g 酵母膏、1.5 g 瓊脂、1000 ml水[4]。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)采用了搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為:30 g 大米粉、1.5 gNaNO3、2.5 gKH2PO4、1.0 gMgSO4.7H2O、1000 ml水，121℃滅菌15 min，接種前pH值調(diào)整到7.0。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子的培養(yǎng)方法

將菌種接種到瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待孢子成熟后將孢子剝下，接入到250 ml三角瓶(100 ml培養(yǎng)液)中，30℃振蕩(150 rpm)培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)后的孢子懸浮液用均質(zhì)器處理打碎后，作為接種液使用(接種體積分?jǐn)?shù)為5%)。

1.3.2 發(fā)酵方法

液態(tài)培養(yǎng)實驗均使用了250 ml三角瓶(100 ml培養(yǎng)液)，振蕩(150 rpm)培養(yǎng)4 d，通風(fēng)量為1.0 vvm，溶解氧含量保持在20%以上。pH值影響研究實驗中使用HCl和NaOH稀溶液調(diào)整。實驗數(shù)據(jù)取三個平行實驗結(jié)果的平均值。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定

取20 ml發(fā)酵液過濾，用蒸餾水洗滌兩次，再置于80℃烘箱中烘干24 h后稱重，即得生物量。

1.4.2 色素的測定

發(fā)酵液過濾后的濾液稀釋后，用紫外可見分光光度計(721型:上海欣茂儀器有限公司)測定500 nm處的OD值，對沒有接種的培養(yǎng)液進(jìn)行相應(yīng)倍數(shù)稀釋，做空白對照。為了分析生物體內(nèi)色素，取20 ml發(fā)酵液中的生物體用蒸餾水洗滌兩次后，用20 ml的95%酒精振蕩萃取，對萃取24 h后的浸提液進(jìn)行離心分離，得到的上清液用適量水稀釋，測OD值[5]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 碳源的影響

為了確定發(fā)酵過程中的適宜碳源，對于不同種類碳源，按30 g/L濃度配制了培養(yǎng)基，發(fā)酵實驗結(jié)果如圖1。本實驗所使用的不同碳源都可被紅曲霉利用，不同種類碳源對紅色素產(chǎn)量的影響是顯著不同的，其中葡萄糖的效果優(yōu)于其他碳源，以葡萄糖作為碳源的例子在文獻(xiàn)報道中也較多[5]?？扇苄缘矸蹠古囵B(yǎng)液粘稠，增加供氣難度。乳糖和蔗糖培養(yǎng)基中只有少量色素產(chǎn)生，因此可以確定葡萄糖為最佳碳源。

葡萄糖濃度對生物增長量和色素產(chǎn)量也有較大影響，濃度影響實驗在5～50 g/L范圍內(nèi)進(jìn)行，葡萄糖濃度為30 g/L時，達(dá)到紅色素最大產(chǎn)量。過高葡萄糖濃度反而導(dǎo)致降低生物生長率和紅色素產(chǎn)量，但是，是否由于產(chǎn)生乙醇影響和限制色素產(chǎn)量，高濃度碳源的具體限制機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

圖1 不同碳源對生物產(chǎn)量和紅色素產(chǎn)量的影響

2.2 氮源的影響

氮源的調(diào)節(jié)作用在微生物的代謝過程中非常重要[6]，不同氮源培養(yǎng)條件下的實驗結(jié)果見圖2。硝酸銨、硝酸鈉、谷氨酸鈉的添加有利于紅曲霉產(chǎn)色素，但生物體產(chǎn)量不如其他氮源，谷氨酸鈉能很好地促進(jìn)色素的合成。大豆粉和酵母提取物可促進(jìn)生物增長，但色素產(chǎn)量不如谷氨酸鈉。但是氯化銨的添加效果比硫酸銨好，這結(jié)果不同于文獻(xiàn)報道，這應(yīng)該是由于不同菌株對氮源的利用情況不同而出現(xiàn)的實驗結(jié)果。谷氨酸鈉的添加濃度影響實驗在0.5～3 g/L范圍內(nèi)進(jìn)行，適宜濃度為1.5 g/L，過高濃度雖有利于生物增長，造成菌體大量合成，但同時影響營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，不利于代謝產(chǎn)物的合成與分泌，從而降低紅色素產(chǎn)量。

圖2 不同碳源對生物產(chǎn)量和紅色素產(chǎn)量的影響

圖3 不同微量元素對生物產(chǎn)量和紅色素產(chǎn)量的影響

2.3 微量元素的影響

考察的Zn2+、Mn2+、Fe2+三種微量元素的影響結(jié)果見圖3，F(xiàn)e2+顯著促進(jìn)了菌體的生長以及紅色素產(chǎn)量 也有促進(jìn)作用，這實驗結(jié)果可能是因為微量元素影響紅曲色素合成酶系統(tǒng)。

2.4 pH值的影響

最佳碳源和氮源確定之后還進(jìn)行了最佳pH值確定實驗，pH值為4.5時，有利于生物增長，pH值在5.5～8.5范圍內(nèi)均有較高色素產(chǎn)量，在pH值小于5.5或大于8.5時，色素產(chǎn)量會明顯降低。pH值在5.5～8.5范圍內(nèi)均有較高色素產(chǎn)量，但未經(jīng)過調(diào)整的培養(yǎng)液pH值接近6.5，因此，最適合紅色素的生成的pH值定為6.5。實驗中還發(fā)現(xiàn)不同碳源和氮源組成時，發(fā)酵過程pH值也發(fā)生不同變化。

2.5 分批培養(yǎng)

在其他研究報告的基礎(chǔ)上[7]，再結(jié)合本實驗結(jié)果，確定培養(yǎng)基組成物質(zhì)后進(jìn)行了分批培養(yǎng)。液態(tài)培養(yǎng)實驗采用的搖瓶旋轉(zhuǎn)速度為700 rpm，因為得到的菌絲可以形成介于漿狀和小球狀中間的混合物，有利于紅色素的生成，而過強(qiáng)烈的攪拌則不利于生物生長，進(jìn)而影響色素產(chǎn)量。

在最佳培養(yǎng)條件下，將紅曲霉液體培養(yǎng)時間延長到7 d，每天測定主要變化，發(fā)現(xiàn)4 d后葡萄糖的消耗很大，同時生物增長的速度也變的緩慢，在1.5d時紅色素開始大量形成，紅色素的變化稍滯后于生物量的變化。4 d后隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，生物量和紅色素量開始減少，微生物應(yīng)該開始進(jìn)入衰退期，因此，在此條件下的最佳培養(yǎng)時間定為4 d。最大生物產(chǎn)量和紅色素產(chǎn)量分別為0.20 gDCW/g葡萄糖和32.5OD500 g/(DCW.h)。

3 結(jié) 論

通過紅曲色素液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，確定了最佳碳源是葡萄糖，氮源是谷氨酸鈉。在30 g/L葡萄糖和1.5 g/L谷氨酸鈉濃度條件下，能夠獲得紅色素的最大產(chǎn)量，色素促進(jìn)效果最佳的是微量元素Fe2+。最適合pH值定為6.5，分批培養(yǎng)時搖床定為700 rpm。在分批發(fā)酵時，最佳工藝條件下得到的生物體產(chǎn)量為0.20 gDCW/g葡萄糖，紅色素產(chǎn)量為32.5OD500 g/(DCW.h)。在本研究中確定了成本較低廉、合理的培養(yǎng)條件來提高液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅色素產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實意義。

[1]周波，王菊芳，吳振強(qiáng)等.高產(chǎn)紅曲黃色素菌株的選育[J].微生物學(xué)通報，2008，35(12):1909－1914.

[2]丁海洋，孟惠惠，盛承承等.紅曲霉JR搖瓶分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的研究[J].中國釀造，2009(12):91－93.

[3]孫菲菲，岳田利，袁亞宏等.紅曲霉菌5040發(fā)酵產(chǎn)生紅曲色素的工藝及其色素特性的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2006，34(6):137－144.

[4]Dominguez-Espinosa R M，Webb C.Submerged fermentation in wheat substrates for production of Monascus pigments[J].World J.Microbiol.Biotechnol.，2003，19(3):329 －336.

[5]楊成龍，楊曉君，何志剛等.碳氮源對紅曲霉S產(chǎn)色素的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26(5):832－836.

[6]Kim C，Jung H，Kim Y，et al.Antimicrobial activities of amino acid derivatives of Monascus pigments[J].FEMS Microbiol.Lett.，2006，264(1):117－124.

[7]李小龍，張鳳琴，劉飛等.氮源對紅曲霉菌株HNLI產(chǎn)色素的影響[J].湖南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，23(5):22－25.