雷 燕，黃 芳，韓林濤，但漢雄，嚴(yán)標(biāo)文，李明明

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室，湖北 武漢 430065;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065)

現(xiàn)代藥理研究表明，瓜蔞－薤白藥對(duì)對(duì)心肌缺血及心肌缺血缺血－再灌注損傷有較好的療效，其改善作用可能與擴(kuò)管、減輕鈣超載、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等有關(guān)[1－7]。近年來(lái)隨著對(duì)心肌缺血保護(hù)機(jī)制的深入研究，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路與心肌缺血的相關(guān)性備受關(guān)注。最新研究表明，MAPK通路可能是預(yù)處理和后處理保護(hù)心肌、抑制損傷的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路機(jī)制的共同靶點(diǎn)。因此，從MAPK信號(hào)通路闡明藥物的保護(hù)機(jī)制出發(fā)，極有希望尋找到理想的治療策略以減輕心肌缺血的損傷[8－11]。筆者在前期基礎(chǔ)上，用SD大鼠建立心肌缺血模型，從MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑深入探討瓜蔞薤白改善急性心肌缺血的作用機(jī)制，以期闡釋瓜蔞－薤白藥對(duì)治療胸痹的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理，從而為最終闡明方劑配伍規(guī)律與內(nèi)涵提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 藥物、動(dòng)物及儀器、試劑

藥物:瓜蔞實(shí)、薤白藥材購(gòu)自于武漢劉有余藥業(yè)有限責(zé)任公司。瓜蔞－薤白藥對(duì)和單味藥均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。瓜蔞煎液，取瓜蔞皮250 g、瓜蔞籽250 g與12%乙醇600mL共煎，減壓濃縮至400mL。薤白煎液，薤白250 g與12%乙醇600mL共煎，減壓濃縮至400mL。瓜蔞－薤白煎液，取瓜蔞實(shí)和薤白(500 g∶250 g)與白酒7 L(低濃度米釀酒，1 400mL)共煎，減壓濃縮至2 L(400mL))。為確保試驗(yàn)結(jié)果的可比性，同一樣品的所有試驗(yàn)都用同一批藥材。含生藥量瓜蔞－薤白煎液為1.875 g/mL，瓜蔞煎液為1.25 g/mL，薤白煎液為 0.625 g/mL。

動(dòng)物:健康SD雄性大鼠，體重150～200 g，清潔級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，合格證號(hào)為SCXK(鄂)2010－0007。

試劑:SDS－PAGE凝膠制備試劑盒，目錄號(hào)為G2003，PMSF(100mmol/L)，目錄號(hào)為G2008，均購(gòu)于谷歌生物。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒BeyoECLPlus，目錄號(hào)為P0018，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所(Beyotime Institute of Biotechnology)。Tween－20，目錄號(hào)為 0777，Amresco公司;蛋白 Marker(10－170 kDa)，目錄號(hào)為sm0671，F(xiàn)ermentas公司;Actin，貨號(hào)為 SC －1616R，SANTA 公司。一抗:BS4322 p－JNK1/2/3(T183/Y185)，BS5016 p－ERK1/2(T202/Y204)，BS4766 p－p38(Y182)，均購(gòu)于 Bioworld公司。二抗:HRP標(biāo)記兔抗山羊，目錄號(hào)為14－13－06;HRP標(biāo)記山羊抗兔，目錄號(hào)為074－1506;HRP標(biāo)記兔抗小鼠，目錄號(hào)為074－1806;HRP標(biāo)記兔抗大鼠，目錄號(hào)為14－16－06;均購(gòu)于KPL公司。2.5% 戊二醛:賽莫飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號(hào)為NUH0180，201011563。

儀器:BL－420S型生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，HX－100E型小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司);DYY－6C型電泳儀(北京市六一儀器廠);752－P型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海現(xiàn)科儀器有限公司);Neofuge 15R型冷凍離心機(jī)(Heal Force公司);WD－9405A型脫色搖床(北京六一儀器廠);HITACHI7080型全自動(dòng)生化分析儀(日本HITACHI公司);LKB－V型超薄切片機(jī)(瑞典BROMMA公司);日立H－600型透射電鏡(日本日立公司);冷凍離心機(jī);－80℃低溫冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

動(dòng)物分組及處理:50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，假手術(shù)(SHAM)組、瓜蔞薤白(TKAM)組(18.75 g/kg)、瓜蔞(TK)組(12.5 g/kg)、薤白(AM)組(6.25 g/kg)、模型(I/R)組，每組 10只。假手術(shù)組和模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液，每日灌胃1次，灌胃容量為10.0mL/kg，連續(xù)灌胃14 d。各組大鼠用10% 水合氯醛麻醉，固定，采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連續(xù)心電監(jiān)測(cè)。行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。經(jīng)左冠狀動(dòng)脈左前降支下淺層心肌穿一5/0號(hào)絲線，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎，其余各組均立即打活結(jié)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，以同步心電圖ST段抬高及心臟局部紫紺為結(jié)扎成功標(biāo)志，形成急性心肌缺血，缺血30min。

組織標(biāo)本采集與檢測(cè):取試驗(yàn)后的大鼠心肌組織，固定于2.5%戊二醛，0.1mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，再用鋨酸(O3O41%)固定，0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，酒精梯度脫水(50%，70%，80%，95%，100%2 次)、每次 15min。純丙酮脫水 2 次(15min)，EPON812:丙酮(1 ∶1)浸透 30min，純包埋液浸透 1 h，純包埋液固化37℃ 24 h后60℃ 48 h。用LKB－V型超薄切片機(jī)(瑞典BROMMA公司)切片，行鈾、鉛染色(醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛)。用H－600型透射電鏡(日本日立公司)觀察(×15 000倍)。

Western Blot法測(cè)定MAPKs表達(dá):心肌缺血研究試驗(yàn)結(jié)束后，取各組心肌組織，提取左心室組織蛋白;取蛋白樣品用于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;上樣，電泳;采用濕式轉(zhuǎn)膜方式檢測(cè)ERK1/2，p38MAPK，C－Jun蛋白表達(dá)，一抗為兔抗人單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG;ECL自顯影技術(shù)觀察蛋白的表達(dá)，從MAPKs信號(hào)通路研究藥對(duì)瓜蔞－薤白藥對(duì)改善急性心肌缺血心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠急性缺血心肌組織學(xué)的影響

假手術(shù)組為正常心肌細(xì)胞，潤(rùn)盤(pán)清晰可見(jiàn)，肌纖維組織排列整齊;模型組線粒體極度腫脹，灶空化，嵴排列凌亂或崩解，肌纖維扭曲;瓜蔞組較模型組稍有改善，肌纖維排列扭曲，可見(jiàn)部分灶空化和嵴排列紊亂;薤白組肌纖維結(jié)構(gòu)無(wú)明顯扭曲，細(xì)胞間質(zhì)有水腫;瓜蔞薤白組線粒體有輕度腫脹，肌纖維排列整齊。詳見(jiàn)圖1。

圖1 電鏡下大鼠急性心肌缺血心肌組織切片(75 KV×15 000)

2.2 對(duì)大鼠急性缺血MAPKs的表達(dá)

由AlphaEase FC凝膠圖像分析軟件取灰度值，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，與瓜蔞、薤白、瓜蔞薤白組相比，假手術(shù)組心肌P－p38表達(dá)極少。瓜蔞薤白、薤白、瓜蔞組兩兩比較，P－p38表達(dá)依次降低，假手術(shù)組P－p38表達(dá)較少。有研究顯示[12]，把模型組的心肌暴露于高含氧量的環(huán)境，心肌功能障礙和梗死面積可大大減輕，而p38MAPK卻大量磷酸化，進(jìn)一步提示了瓜蔞－薤白煎液可抑制被激活的p38信號(hào)通路，減少由其引起的心肌損傷，對(duì)心臟起到保護(hù)作用。此外，由表1也可看出，給藥組與模型組中，P－JNK的表達(dá)在瓜蔞薤白組中最少，說(shuō)明瓜蔞－薤白藥對(duì)抑制了JNK通路的表達(dá)，同樣也降低了由于急性心肌梗死引起的心肌損傷，從而起到了保護(hù)心臟的作用。各個(gè)給藥組依次比較，可以看出，在瓜蔞薤白藥對(duì)的誘導(dǎo)作用下，各給藥組P－ERK的表達(dá)均依次增加。

表1 瓜蔞薤白對(duì)大鼠心肌急性缺血MAPKs通路的表達(dá)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，對(duì)瓜蔞－薤白藥對(duì)中瓜蔞、薤白單味藥的藥理研究較多。為了深化瓜蔞－薤白藥對(duì)的藥理學(xué)研究，更好地利用瓜蔞、薤白資源，本試驗(yàn)驗(yàn)探討了瓜蔞－薤白藥對(duì)單用與配伍后大鼠抗急性心肌缺血心肌損傷中心肌組織學(xué)的影響和MAPKs信號(hào)通路在其中的作用。且本次試驗(yàn)在已有文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上[13－14]，選取了相對(duì)居中的瓜蔞－薤白煎液的有效質(zhì)量濃度(1.875 g/mL)，進(jìn)一步證明了以下結(jié)論:瓜蔞薤白配伍后抗心肌組織損傷的效果更顯著;3種絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號(hào)通路參與了瓜蔞薤白抗大鼠急性心肌缺血所致心肌損傷作用的分子機(jī)制，并起到了不同的作用，且瓜蔞－薤白藥對(duì)配伍后的結(jié)果更明顯。

絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)是一組絲氨酸－蘇氨酸激酶系，受各種刺激激活，如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞應(yīng)激等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)證實(shí)3種主要的MAPKs信號(hào)途徑包括細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)蛋白激酶(ERK1/2)，p38MAPK和c－Jun氨基端蛋白激酶(JNKs)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPKs)?；罨腗APKs轉(zhuǎn)位入核后引起轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，提高應(yīng)激蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平，合成相關(guān)蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

已有研究證實(shí)，MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并在引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用。目前，已發(fā)現(xiàn)存在著多條并行的MAPKs信號(hào)通路，不同的細(xì)胞外刺激可使用不同的MAPKs信號(hào)通路，通過(guò)其相互調(diào)控而介導(dǎo)不同的細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)[15]。其中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK(extracellular signal－relat－ed kinase)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理功能，是傳遞絲裂原信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。它正常定位于胞漿，有絲分裂原刺激后部分類(lèi)型的ERK能向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，并具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的能力，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。JNK是一種應(yīng)激激活的蛋白激酶，由于JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，并被多種細(xì)胞外應(yīng)激信號(hào)激活，因而JNK也被稱(chēng)為應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)。SAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑極其復(fù)雜，并與ERK及p38MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有密切關(guān)系。

p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路在炎癥、應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)的多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。p38在細(xì)胞核內(nèi)和胞質(zhì)都有表達(dá)。在應(yīng)激條件下，胞質(zhì)內(nèi)的p38可以轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，通過(guò)磷酸化激活各種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。有報(bào)道稱(chēng)[16]，缺血使p38磷酸化的程度很小，但本試驗(yàn)可以證明，在瓜蔞－薤白藥對(duì)的作用下，p38的磷酸化會(huì)顯著增高，提示給藥后的心肌缺血可使大量細(xì)胞因子激活，進(jìn)一步推論出p38的磷酸化與心肌缺血引起的心肌損傷產(chǎn)生的過(guò)氧化物激活有關(guān)[17]。

心肌缺血及缺血－再灌注損傷在中醫(yī)學(xué)中屬于“胸痹”“心痛”等范疇。栝蔞薤白半夏湯出自《金匱要略·胸痹》篇，是臨床治療胸痹的有效方。該方可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮和內(nèi)皮素平衡有效防治急性心肌缺血損傷[18－19]。本試驗(yàn)通過(guò)建造心肌缺血－再灌注模型，觀察MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)來(lái)研究瓜蔞薤白藥對(duì)對(duì)急性缺血損傷心肌的影響及可能性機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與I/R組對(duì)照其他各組中，TKAM組P－p38、P－JNK的表達(dá)與SHAM組最為接近，而P－ERK的表達(dá)在TKAM組中最多。由此推論，瓜蔞薤白煎液能有效抑制大鼠急性心肌缺血心肌損傷，其機(jī)制之一可能與MAPKs的3條信號(hào)通路的活化相關(guān)。

MAPKs 3種信號(hào)途徑均可在心肌缺血－再灌注損傷過(guò)程中激活。如缺血前激活心肌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路，對(duì)于介導(dǎo)心臟內(nèi)源性保護(hù)配體有著一定的作用[20]。p38MAPKs和JNK/SAKPs是急性心肌缺血后心肌凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，在決定心肌缺血損傷程度方面扮演了重要角色[21－22]。

[1]黃詠梅，鄧景贊，肖加尚.瓜蔞薤白湯加減浸膏的藥效學(xué)研究[J].中藥材，2004，27(9)∶667 －669.

[2]李 鵬，沈?qū)毞?，何立?心痛寧加味方對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J].江西中醫(yī)藥，2004，35(11)∶62－63.

[3]劉貴京，蘇安英，張建敏.加減瓜蔞薤白半夏湯改善缺血心肌細(xì)胞鈣超載的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2004，7(8)∶539 －541.

[4]吳啟端，方永奇，陳奕芝.加味瓜蔞薤白湯對(duì)心肌缺血大鼠作用的機(jī)理研究[J].中華臨床醫(yī)藥，2004，5(7)∶45 －47.

[5]張 騰，曹洪欣，盛小禹.溫心膠囊對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性缺血心肌細(xì)胞凋亡及 Bcl－2、Fas蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23(10)∶769 － 771.

[6]張 騰，曹洪欣，殷惠軍.溫心膠囊對(duì)異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2001，8(1)∶36－37.

[7]陳 彬，張世瑋，陸 茵.瓜萎薤白藥對(duì)對(duì)大鼠心肌缺血及再灌注損傷的保護(hù)[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17(7)∶1 －2.

[8]吳 波，陳思維，曹 虹，等.薤白提取物對(duì)心肌缺氧缺血及缺血再灌注心肌損傷的保護(hù)作用[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，18(2)∶131－133.

[9]吳洪元 .薤白的炮制研究[J].中藥材，1995，18(4)∶192－194.

[10]陳麗萍，白旭東，于國(guó)良.高分辨率超聲觀察薤白制劑對(duì)高脂血癥的治療作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2002，22(3)∶182 －183.

[11]孟慶國(guó)，朱慶磊，鄧淑娥，等.薤白水提物對(duì)羥自由基的清除作用 [J].濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，20(1)∶66 －67.

[12]JRuusalepp A，Czibik G，F(xiàn)lateb T，etal.Myocardial protection evoked by hyperoxie exposure involves signaling through nitric oxide and mitogen activated protein kinases[J].Basic Res Cardiol，2007，102∶318 － 326.

[13]靳秀明，劉貴京，王慶書(shū)，等.加減瓜蔞薤白半夏湯對(duì)大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(9)∶1205－1 206.

[14]張承志，韓林濤，黃 芳，等.“瓜蔞－薤白”藥對(duì)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].湖北中醫(yī)雜志，2012，34(7)∶19－21.

[15]樊 哲，田曉峰，潘吉勇，等.腸缺血再灌注中的MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2011，6(6)∶249 －251.

[16]Zhou Y，Wang Q，Evers BM，etal.Signal transduction pathways involved in oxidative stress－induced intestinal epithelial cell apoptosis[J].Pediatr Res，2005，58(6)∶1 192 － 1 197.

[17]Kim SJ，Jeong CW，Bae HB，etal.Protective Effectof Sauchinone Against Regional Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury:Inhibition of p38 MAPK and JNK Death Signaling Pathways[J].The Korean Academy of Medical Sciences，2012，27(5)∶572 － 575.

[18]張炳填，李鑫輝.栝蔞薤白半夏湯對(duì)急性心肌缺血大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].新中醫(yī)，2007，39(3)∶104 －106.

[19]李鑫輝，張炳填.栝蔞薤白半夏湯對(duì)急性心肌缺血大鼠保護(hù)作用的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(3)∶19 －25.

[20]Bogoyevitch MA，Gillespie－ Brown J，Ketterman AT.Stimulation of the stress－activated mitogen－activated protein kinase subfamilies in perfused heart.p38/RK mitogen－activated protein kinases and c－Jun N－terminal kinases are activated by ischemia/reper fusion[J].Circulation Research，1996，79(6)∶162 － 173.

[21]MAX －L，Kumar S，Gao F.Inhibition of p38 mitogen－activated protein kinase decreases cardiomyocyte apoptosis and improves cardiac function aftermyocardial ischemia and reperfusion[J].Circulation，1999，99(13):1 685－1 691.

[22]FerrandiC，BalleriR，Gaillard P，etal.Inhibition of c－Jun N －terminal kinase decreases cardiomyocyte apoptosis and in farctsize aftermyocardial ischemia and reperfusion in anaesthetized rats[J].Br JPharmacol，2004，142(6)∶953 －960.