隆昱洲雷進(jìn)羅麗華陳婷婷孫倩倩褚嘉祐楊昭慶孫浩

肌張力障礙（dystonia）是一種不自主、持續(xù)性肌肉收縮引起的扭曲、重復(fù)運(yùn)動(dòng)或姿勢(shì)異常的綜合癥[1]。臨床上，癥狀單一（震顫除外）并無神經(jīng)退化或其它獲得性因素引起的肌張力障礙，一般稱為原發(fā)性肌張力障礙（primary dystonia）[2]?；蛘吒鶕?jù)發(fā)病年齡可分為早發(fā)型（26歲前發(fā)病）和遲發(fā)型（26歲后發(fā)?。1,3]。隨著對(duì)引起肌張力障礙發(fā)生遺傳因素的不斷研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多個(gè)基因座位與其發(fā)生相關(guān)[4-5]。其中最早發(fā)現(xiàn)的TOR1A（也稱為DYT1）基因在早發(fā)型肌張力障礙中占有非常重要的作用[6]，其第五外顯子區(qū)的GAG三核苷酸刪除（904_906delGAG，GenBank序號(hào)：rs80358233）是引起早發(fā)型的肌張力障礙的主要遺傳因素[7]。但現(xiàn)在對(duì)在遲發(fā)型的肌張力障礙患者中此基因的突變及其是否有群體特異性情況仍不清楚。因此本研究對(duì)122例原發(fā)性肌張力障礙患者及100名正常對(duì)照TOR1A的第五外顯子進(jìn)行測(cè)序，了解此基因突變?cè)谥袊髂系貐^(qū)漢族肌張力障礙患者中的分布情況，并尋找此基因第五外顯子有無新的可能致病突變。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者組為2011年至2012年來我院進(jìn)行檢查的肌張力障礙患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合Geyer等[1]2006年建議診斷標(biāo)準(zhǔn)及原發(fā)性肌張力障礙的定義[2]；②癥狀單一，無神經(jīng)退化或其他獲得性因素引起的原發(fā)性肌張力障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他癥狀疊加的肌張力障礙患者；或獲得性/外生的（acquired/exogenous）的肌張力障礙患者。共收集原發(fā)性肌張力障礙患者122例，年齡13～83歲，平均（53.9±14.9）歲，男42例，女80例。對(duì)照組來自本院體檢者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞50周歲，無神經(jīng)退行性病變癥狀。共收集100名，年齡50～65歲，平均（56.5±4.3）歲，男40名，女60名。兩組年齡（t=-1.62，P=0.108）、性別分布（χ2=0.73，P=0.39）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理委員會(huì)同意。

1.2 研究方法

1.2.1 患者分類 收集患者發(fā)病年齡、病程長短及發(fā)病部位等信息。并根據(jù)一般國際通行的標(biāo)準(zhǔn)[1,8]，以26歲為界限，將肌張力障礙患者分為早發(fā)型（≤26歲）和晚發(fā)型（＞26歲）兩類。

1.2.2 TOR1A基因第五外顯子測(cè)序 采集所有研究對(duì)象外周血5 mL，并用肝素鈉抗凝。各血液樣本取250μL，使用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒（AxyGen，中國）進(jìn)行DNA抽提。使用引物F：5'-GGTAGGTAAGTGACCCCCAG-3'和 R:5'-AAAAAACACACACACAAGGC-3'對(duì)目的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為（PCR試劑來自TaKaRa公司）：DNA 樣本 20 ng，MgCl2（25 mmol/L）1.2 μL；dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL；正反向引物（5 μmol/L）各1 μL；TaKaRaTaq酶（55 U/μL）0.16 μL；10×PCR Buffer2.5 μL；加水至總體積20 μL。擴(kuò)增條件為：94℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72℃10 min。擴(kuò)增目的片段包括TOR1A基因（GenBank序號(hào)：NM_000113）第五外顯子5'端81 bp的內(nèi)含子區(qū)域；覆蓋了第五外顯子的所有氨基酸編碼區(qū)，并包含其3'非翻譯區(qū)420 bp長度區(qū)域。擴(kuò)增片段共長752bp。

擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System PCR純化試劑盒（Promega，美國）進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物用BigDye Terminator v1.1試劑盒（Applied Biosystems，美國），分別用上述PCR引物進(jìn)行雙向測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物在3130 DNA測(cè)序儀（Applied Biosystems，美國）進(jìn)行電泳，結(jié)果用Sequencer Analysis V5軟件（Applied Biosystems，美國）和軟件Chromas進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 獲得測(cè)序結(jié)果后，參考數(shù)據(jù)庫中原序列（NM_000113.2）劃定第五外顯子范圍，并對(duì)比患者組與對(duì)照組之間的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸有無改變。確定在本研究群體中突變情況。并計(jì)算其突變頻率。所計(jì)量資料用“±s”描述，計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比描述，并采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于在基因3'非翻譯區(qū)檢測(cè)到的突變用TargetScan軟件[9]，根據(jù)已知miRNA與基因3'作用的規(guī)律，預(yù)測(cè)突變是否對(duì)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生影響。并根據(jù)突變所在DNA區(qū)段在不同物種中的保守性，評(píng)估此突變是否可能是潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，是否可能影響基因表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 患者特征與比例 122例肌張力障礙患者中，早發(fā)型肌張力障礙患者占7.4%（9/122）。在遲發(fā)型患者中，最多為節(jié)段性顱頸肌張力障礙（Meige綜合癥），占40.7%（46/113）；其次為局部性眼瞼痙攣（38.9%，44/113）和局部性痙攣性斜頸（15.0%，17/113）（見表1）。

2.2 TOR1A基因第五外顯子測(cè)序 對(duì)TOR1A基因第五外顯子進(jìn)行雙向測(cè)序顯示，8例患者此區(qū)域有突變，共檢測(cè)到5種突變，其中包括多在早發(fā)型肌張力障礙患者中發(fā)現(xiàn)的突變904_906delGAG及數(shù)據(jù)庫中未收錄的突變m.1378TT＞TA。對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)904_906delGAG及m.1378TT＞TA突變?；颊咄蛔冾愋团c癥狀，見表2。904_906delGAG突變的純合子、雜合子以及正常對(duì)照序列的反向測(cè)序結(jié)果見圖1 A。新發(fā)現(xiàn)未收錄入庫的突變m.1378TT＞TA的雙向測(cè)序結(jié)果列于圖1 B中。

2.3 突變頻率及miRNA作用位點(diǎn)預(yù)測(cè) 在9例早發(fā)型肌張力障礙患者中，1例攜帶904_906del-GAG突變；遲發(fā)型患者中，攜帶904_906delGAG突變的患者占2.7%（3/113）。在所有肌張力障礙患者中共有4例攜帶此突變，另有1例為純合子，此突變?cè)诩埩φ系K患者中的基因頻率為2.1%（5/244）。

對(duì)位于TOR1A基因3'非翻譯區(qū)所檢測(cè)到的突變，根據(jù)已知miRNA與基因相互作用規(guī)律進(jìn)行推測(cè)，并據(jù)突變所在DNA區(qū)段在不同物種中的保守性比對(duì)，數(shù)據(jù)庫中收錄的3個(gè)SNP（rs75881350，rs1182和rs1183）均未發(fā)現(xiàn)這3個(gè)SNP與已知miRNA 結(jié)合的可能；新發(fā)現(xiàn)的 SNPm.1378TT＞TA 在人、黑猩猩、大猩猩、獼猴、鼠和兔等哺乳動(dòng)物中保守，并且其可能為miRNA hsa-miR-494的潛在結(jié)合位點(diǎn)。

表1 122例肌張力障礙患者分類

表2 8例有突變患者的突變類型及癥狀

圖1 突變測(cè)序圖 A:為904_906delGAG突變反向測(cè)序圖，示正常序列、突變純合子及雜合子，圖中黑框?yàn)閯h除的三堿基GAG互補(bǔ)序列CTC；B:為突變m.1378TT＞TA雙向測(cè)序圖，箭頭所指為突變位點(diǎn)

3 討論

TOR1A基因（也稱DYT1）編碼蛋白torsinA，此基因在腦中各部位廣泛表達(dá)，特別是在中腦灰質(zhì)區(qū)。TOR1A編碼蛋白為腺苷三磷酸酶（ATPase）AAA+超家族中的一員[2]。此家族基因參與膜融合，蛋白水解和DNA復(fù)制等多種細(xì)胞生物學(xué)過程，其功能主要是與蛋白的折疊有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為它們是一種分子伴侶[10]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，帶有904_906delGAG的基因的突變torsinA蛋白（DeltaE302）會(huì)導(dǎo)致蛋白形態(tài)的改變，使得這一原本位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白出現(xiàn)于核膜上[11]。同時(shí)這一突變蛋白也使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變。這些改變引起了多巴胺釋放神經(jīng)細(xì)胞的損傷，從而可能導(dǎo)致肌張力障礙。在一些小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，此基因的過表達(dá)也可引起小鼠的運(yùn)動(dòng)異常[12]。

盡管體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)均指出此基因突變可能為肌張力障礙發(fā)病的原因，但是此突變?cè)诩埩φ系K發(fā)病遺傳因素中所占比例，及此基因是否還有其它突變也能引起肌張力障礙仍有待討論。最初的研究顯示[13]，904_906delGAG突變?cè)诘乱岐q太人的早發(fā)型肌張力障礙患者中出現(xiàn)的頻率非常高（大于90%），因此人們認(rèn)為其可能是早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙的主要遺傳病因。但隨著對(duì)多個(gè)群體的研究以及對(duì)德裔猶太人起源的辨認(rèn)，人們發(fā)現(xiàn)在不同的群體中早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙患者攜帶此致病突變的比例有群體特異性；德裔猶太人攜帶高頻的904_906delGAG突變，可能是因?yàn)槿后w遺傳學(xué)上奠基者效應(yīng)的影響。我們綜合對(duì)比這些數(shù)據(jù)（見表3），可見在歐洲群體中英法德地區(qū)[14-16]，此突變?cè)谠绨l(fā)型患者中所占比例較高，通常大于30%。而在另一些歐洲群體[17-18]及大部分亞洲群體中[19-22]，904_906delGAG突變?cè)谠绨l(fā)型肌張力障礙患者中所占比例只有10～20%左右。特別是在中國漢族群體中，無論是臺(tái)灣[22]、吉林[21]還是本研究中對(duì)云南漢族的研究均顯示，此突變?cè)谠绨l(fā)型肌張力障礙患者中所占比例在10%左右。因此，我們認(rèn)為在中國人群中此突變并不能解釋大部分早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙的病因。中國漢族人群可能攜帶有其它非此突變的遺傳因素而導(dǎo)致早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙，對(duì)于中國人群早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙的遺傳病因仍然值得探討。

表3 突變類型及攜帶者癥狀

討論了904_906delGAG突變導(dǎo)致早發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙后，世界各地的研究小組也對(duì)其在遲發(fā)型原發(fā)性肌張力障礙中的出現(xiàn)頻率進(jìn)行了討論。這些結(jié)果同樣列于表3中。在大部分研究群體中，均沒有在遲發(fā)型肌張力障礙患者中檢測(cè)到904_906delGAG突變。只在德國及日本樣本中各檢測(cè)到1例，其頻率均小于1%[15,20]。但在本研究中，在113例遲發(fā)型肌張力障礙患者中檢測(cè)到3例攜帶此突變的患者（2.7%）。此頻率高于其它報(bào)道人群。雖然可能因樣本量小帶來偏倚，但本研究仍說明了此突變能導(dǎo)致遲發(fā)型肌張力障礙，并且在中國西南遲發(fā)型肌張力障礙患者群體中頻率略高。這一現(xiàn)象在已報(bào)道的人群中較為少見，因此我們推測(cè)在云南漢族群體中是否有可能存在一種特殊機(jī)制，使肌張力障礙的發(fā)病“推遲”。云南地理位置特殊，處于高原低氧及濕熱環(huán)境，并且云南的漢族人群有特殊的人口歷史學(xué)來源。這些特殊的環(huán)境及遺傳因素與904_906delGAG突變致病關(guān)系的揭示，可能為肌張力障礙發(fā)生的分子機(jī)制提供有益幫助。

本研究發(fā)現(xiàn)1例純合型的904_906delGAG突變患者，此患者中突變TOR1A基因的表達(dá)量有可能為攜帶雜合突變患者的兩倍。但從癥狀來看，攜帶純合突變病人與其它攜帶雜合突變的患者差別并不大，如：發(fā)病年齡仍為30歲，并沒有顯著提前。因此我們推測(cè)，904_906delGAG突變致肌張力障礙發(fā)生的病理機(jī)制可能較為復(fù)雜，突變基因表達(dá)量和疾病的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)位于TOR1A基因3'非翻譯區(qū)的一個(gè)新突變：m.1378 TT＞TA。經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬分析發(fā)現(xiàn)，此位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中保守，并可能是hsamiR-494的潛在結(jié)合位點(diǎn)。如其突變可能影響到miR-494的結(jié)合，從而引起TOR1A基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，此突變有可能是一個(gè)導(dǎo)致肌張力障礙發(fā)生的遺傳因素。小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵诧@示[12]，TOR1A的表達(dá)量的改變能引起小鼠運(yùn)動(dòng)障礙。僅僅根據(jù)本研究的病例對(duì)照對(duì)比，對(duì)突變m.1378 TT＞TA在引起肌張力障礙中的作用仍不能下結(jié)論。但此突變與TOR1A基因的表達(dá)關(guān)系，及其與肌張力障礙發(fā)生的關(guān)系在將來也非常值得研究的。

綜上所述，904_906delGAG也是導(dǎo)致云南漢族人群中遲發(fā)型肌張力障礙發(fā)生的遺傳因素。并且云南群體可能存在特異的肌張力障礙遺傳變異譜。更大規(guī)模的肌張力障礙患者遺傳學(xué)篩查，及更深入的機(jī)制研究仍是非常值得進(jìn)行的。

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