周琛 張為西 冷雁 鄭振揚 馬震宇 鐘志剛

A型肉毒毒素（botulinum toxin type A，BTXA）是厭氧梭狀芽孢桿菌代謝過程中產(chǎn)生的一種極強的外毒素，由于其化學(xué)性去神經(jīng)支配作用，近年來逐漸成為治療面肌痙攣等多種肌張力障礙疾病的重要手段[1]。然而，關(guān)于BTX-A局部注射合適的稀釋度目前尚無統(tǒng)一意見[2]。Gracies等[3]認(rèn)為高稀釋度的BTX-A局部注射痙攣性偏癱患者肱二頭肌，可發(fā)揮更強的神經(jīng)肌肉阻滯作用，減輕協(xié)同收縮及痙攣狀態(tài)，改善肘關(guān)節(jié)主動伸展運動；而Lee等[4]研究表明，用不同稀釋度BTX-A局部注射治療腦癱患兒，對患兒運動功能及步態(tài)改善無顯著性差異。為明確不同稀釋度BTX-A局部肌肉注射的治療效應(yīng)，以及是否對局部肌肉、神經(jīng)產(chǎn)生損害，本研究用C57BL/6J小鼠作為動物模型，對BTX-A合適的稀釋度進(jìn)行探索性研究，為臨床合理應(yīng)用BTX-A提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年C57BL/6J小鼠25只，體重18～26g，雌雄不限，購于中山大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心SPF級動物室。

1.1.2 主要試劑 BTX-A（蘭州生物制品研究所，規(guī)格50U/瓶，批號：20090903）；兔抗小鼠神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，N-CAM）多克隆抗體（Millipore，美國）；山羊抗兔熒光標(biāo)記二抗（Millipore，美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組與處理 將25只C57BL/6J小鼠隨機分為5組：其中4組小鼠的右側(cè)腓腸肌分別用微量進(jìn)樣器局部注射新鮮稀釋度為 1.25U/0.1mL、2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL、10.00U/0.1mL 的 BTX-A，注射劑量均為0.025U；其余1組切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)作為陽性對照（去神經(jīng)支配組）；左側(cè)腓腸肌注射等量生理鹽水作為陰性對照。

1.2.2 趾運動評分 小鼠腓腸肌注射BTX-A后，第1～14天每天采用趾外展運動5級評分法[5]（0分為正常，4分為最大程度的減少腿外伸和趾外展）評價小鼠骨骼肌運動功能恢復(fù)情況，即抓住小鼠尾巴使小鼠懸空以引出其特有的驚恐反應(yīng)，即伸展后腿和外展后腿的腳趾。

1.2.3 腓腸肌動作電位 C57BL/6J小鼠麻醉后固定，玻璃分針游離坐骨神經(jīng)，連接刺激電極、記錄電極、地線，啟動BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)和刺激器，刺激強度從0開始逐漸增加，當(dāng)刺激強度增加到剛能引起微小動作電位時，此刺激強度稱為閾強度，記錄其數(shù)值；當(dāng)刺激強度引起的動作電位幅值達(dá)最大時，再增加刺激強度，動作電位幅值不再增加，則剛好能引起最大幅值動作電位的刺激強度稱為最大刺激強度，記錄其數(shù)值；觀察雙向動作電位，記錄潛伏期、動作電位峰值[6]。

1.2.4 腓腸肌稱重 BTX-A注射后14d，頸椎脫臼法處死小鼠，完整取出雙側(cè)腓腸肌分別進(jìn)行稱重，計算右/左側(cè)腓腸肌重量比，觀察右側(cè)腓腸肌萎縮程度。

1.2.5 HE染色 BTX-A注射后14d，取小鼠腓腸肌組織冰凍切片行常規(guī)HE染色。

1.2.6 免疫熒光檢測 BTX-A注射后14d，取小鼠腓腸肌組織冰凍切片行組織免疫熒光檢測。PBS漂洗后用山羊血清封閉，滴加兔抗小鼠N-CAM抗體（1：500），濕盒中孵育過夜，PBS漂洗后滴加山羊抗兔熒光標(biāo)記二抗（1：400），避光濕盒中孵育1h，使用熒光正置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 電子顯微鏡檢測腓腸肌肌肉、神經(jīng) BTX-A注射后14d，取小鼠腓腸肌組織冷卻固定并切成小塊，經(jīng)固定、梯度酒精脫水等處理后超薄切片，進(jìn)行鉛-鈾雙重染色，沖洗干凈并使樣品自然干燥，金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，使用飛利浦CM-10電鏡觀察小鼠腓腸肌肌肉、神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用（±s）描述，多組間小鼠趾運動評分比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，多組小鼠腓腸肌動作電位、右/左腓腸肌重量比的比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 趾運動評分 采用重復(fù)測量資料的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，處理主效應(yīng)即不同稀釋度BTX-A處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.825，P＜0.001），時間主效應(yīng)即不同時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1231.350，P＜0.001），處理與時間的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.475，P＜0.001）。兩兩比較結(jié)果表明：BTX-A注射后1～7 d，不同處理組小鼠趾運動評分均降低，但稀釋度為 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL、10.00U/0.1mL 處理組肌力均較 1.25U/0.1mL組下降較明顯（均P＜0.001）；在BTX-A注射后7～14 d，稀釋度為 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL 處理組均較10.00U/0.1mL組小鼠趾運動恢復(fù)不明顯（均P＜0.001）。見表1。

表1 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠趾運動評分（±s）

表1 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠趾運動評分（±s）

注射前0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0組別1.25U/0.1mL 2.50U/0.1mL 5.00U/0.1mL 10.00U/0.1mL陽性對照組n 5 5 5 5 5注射后1d 3.0±0.7 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0注射后7d 3.0±0.7 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0 4.0±0.0注射后14d 2.2±0.4 3.4±0.5 3.6±0.5 2.2±0.4 4.0±0.0

2.2 小鼠腓腸肌動作電位 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠腓腸肌動作電位比較采用方差分析，閾強度電位（F=10.311，P＜0.001）、最大刺激強度（F=22.069，P＜0.001）、潛伏期（F=94.712，P＜0.001）、動作電位峰值（F=164.649，P＜0.001）組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較結(jié)果表明，在閾強度電位和最大刺激強度方面，2.50U/0.1mL組、5.00U/0.1mL 組比 1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL 處理組、陰性對照組大（均P＜0.001），即需要較強刺激才能引起肌肉收縮；在潛伏期和動作電位峰值方面，各BTX-A處理組均比陰性對照組潛伏期延長（均P＜0.001）、動作電位峰值降低（均P＜0.001），其中2.50U/0.1mL組和5.00U/0.1mL組比1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL處理組的潛伏期更長（均P＜0.001）、動作電位峰值更低（均P＜0.001）。見表2。

表2 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠腓腸肌動作電位（±s）

表2 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠腓腸肌動作電位（±s）

1）與陰性對照組比較比較，經(jīng) LSD-t檢驗，P＜0.001；2）與 1.25U/0.1mL 組比較，經(jīng) LSD-t檢驗，P＜0.001；3）與 10.00U/0.1mL 處理組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.001。

閾強度電位（V）0.30±0.10 0.50±0.101)2)3)0.50±0.101)2)3)0.30±0.05 0.25±0.05動作電位峰值（mV）5.42±0.111)3.03±0.121)2)3)3.14±0.261)2)3)6.23±0.401)10.40±1.05組別1.25U/0.1mL 2.50U/0.1mL 5.00U/0.1mL 10.00U/0.1mL陰性對照組n 5 5 5 5 5最大刺激強度（V）0.70±0.10 1.60±0.201)2)3)1.46±0.321)2)3)0.73±0.31 0.53±0.15潛伏期（ms）0.82±0.081)1.23±0.101)2)3)1.16±0.111)2)3)0.81±0.111)0.18±0.06

2.3 小鼠右左腓腸肌重量比 BTX-A注射后14天，不同稀釋度BTX-A處理組小鼠右/左腓腸肌重量比值組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=390.462，P＜0.001）。兩兩比較結(jié)果表明：稀釋度為 1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL 組比陽性對照組大（均 P＜0.001），而 2.50U/0.1mL 組（P=0.119）、5.00U/0.1mL組（P=0.688）與陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。如表3所示。

表3 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠右/左腓腸肌重量比（±s）

表3 不同稀釋度BTX-A處理組小鼠右/左腓腸肌重量比（±s）

1）與陽性對照組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，P＜0.001

右/左腓腸肌重量比0.61±0.011)0.44±0.01 0.45±0.02 0.65±0.011)0.46±0.01組別1.25U/0.1mL 2.50U/0.1mL 5.00U/0.1mL 10.00U/0.1mL陽性對照組n 5 5 5 5 5

2.4 HE染色 BTX-A注射后14d，不同處理組小鼠腓腸肌均呈現(xiàn)細(xì)胞大小不一，部分肌細(xì)胞變圓、核內(nèi)移，少量肌細(xì)胞間隙增大，稀釋度為2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL組較1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL組肌細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞萎縮較明顯，如圖1 A1～F1所示。

AIS是較常見腦血管類疾病[7]。有研究顯示，炎癥反應(yīng)在AIS的發(fā)病及預(yù)后中發(fā)揮重要作用，其中，細(xì)胞因子作為炎癥反應(yīng)所釋放出的炎癥介質(zhì)，在AIS發(fā)生過程中起一定的調(diào)節(jié)作用[8-9]。IL-33可通過多種細(xì)胞和組織表達(dá)，對心腦血管起保護(hù)作用[10-11]。CXCL12可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，較好地促進(jìn)組織及血管再生。

2.5 免疫熒光檢測 BTX-A注射后14d，免疫熒光檢測小鼠腓腸肌N-CAM表達(dá)。稀釋度為2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL處理組 N-CAM 陽性表達(dá)細(xì)胞較稀釋度為 1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL 處理組為多，如圖1 A2～F2所示。

2.6 電子顯微鏡檢測 BTX-A注射后14d，稀釋度為 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL 處理組較稀釋度為1.25U/0.1mL、10.00U/0.1mL 處理組肌肉及神經(jīng)結(jié)構(gòu)變性顯著，可見其肌漿網(wǎng)明顯腫脹、線粒體空泡變性、肌節(jié)排列紊亂，神經(jīng)軸索、髓鞘變性，軸索萎縮、髓鞘凹陷、細(xì)胞器腫脹變性、外膜崩解、神經(jīng)絲纏結(jié)，如圖1 A3～F4所示。

3 討論

BTX-A選擇性作用于外周膽堿能運動神經(jīng)元的突觸前膜，與突觸囊泡蛋白2結(jié)合后被攝取，通過降解突觸小體相關(guān)蛋白-25，導(dǎo)致不能形成突觸融合復(fù)合體，突觸小囊與突觸前膜融合受阻，抑制突觸前膜釋放含有乙酰膽堿的囊泡，阻斷神經(jīng)沖動傳遞，使其支配的效應(yīng)器官（肌肉等）出現(xiàn)功能減弱，引起肌肉松弛性麻痹，這種作用稱為化學(xué)性去神經(jīng)支配作用[7-8]。本研究通過觀察BTX-A局部注射對作為運動效應(yīng)器的肌肉以及支配該肌肉的周圍神經(jīng)的影響，間接反映BTX-A的化學(xué)性去神經(jīng)支配作用。

圖1 不同稀釋度BTX-A處理組注射后14d小鼠腓腸肌形態(tài)學(xué)變化。A1～A4：1.25U/0.1mL 處理組；B1～B4：2.50U/0.1mL 處理組；C1～C4：5.00U/0.1mL處理組；D1～D4：10.00U/0.1mL處理組；E1～E4：陰性對照組；F1～F4：陽性對照組（A1～F2，200×；A3～F4，10000×）。A1～F1：HE染色，示稀釋度為2.50U/0.1mL（B1）、5.00U/0.1mL處理組（C1）較1.25U/0.1mL（A1）、10.00U/0.1mL處理組（D1）肌細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞萎縮明顯；A2～F2：免疫熒光檢測N-CAM表達(dá)，示稀釋度為 2.50U/0.1mL（B2）、5.00U/0.1mL 處理組（C2）NCAM 陽性表達(dá)細(xì)胞較稀釋度為 1.25U/0.1mL（A2）、10.00U/0.1mL處理組（D2）為多；A3～F3：電鏡檢測小鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)，示稀釋度為2.50U/0.1mL（B3）、5.00U/0.1mL處理組（C3）較稀釋度為1.25U/0.1mL（A3）、10.00U/0.1mL 處理組（D3）肌肉變性明顯，可見肌漿網(wǎng)腫脹、線粒體空泡變性、肌節(jié)排列紊亂；A4～F4：電鏡檢測小鼠神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)，示稀釋度為2.50U/0.1mL（B4）、5.00U/0.1mL處理 組（C4）較稀釋度為 1.25U/0.1mL（A4）、10.00U/0.1mL 處理組（D4）軸索、髓鞘變性明顯，可見軸索萎縮、髓鞘凹陷、細(xì)胞器腫脹變性、外膜崩解、神經(jīng)絲纏結(jié)。

本研究采用BTX-A對C57BL/6J小鼠腓腸肌進(jìn)行局部注射后，小鼠趾運動評分顯示：2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL BTX-A 導(dǎo)致小鼠骨骼肌肌力較快下降，腓腸肌需要較強刺激才能引起收縮，且收縮較慢、收縮強度較??；免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL 處理組腓腸肌 N-CAM陽性表達(dá)較多，表明其化學(xué)性去神經(jīng)支配作用較強。N-CAM是一種膜糖蛋白，它只在胚胎期肌管表達(dá)，在生長發(fā)育過程中不再表達(dá)，但當(dāng)肌肉去神經(jīng)支配后，可誘發(fā)N-CAM重新聚集于肌纖維表面，可作為BTX-A化學(xué)性去神經(jīng)支配效應(yīng)的敏感檢測指標(biāo)[9]；電鏡下2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL處理組肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂、Z線斷裂、線粒體增多、空泡變性較顯著，神經(jīng)軸索、髓鞘變性也較明顯，提示其化學(xué)性去神經(jīng)支配作用較其他處理組強。因此，本研究發(fā)現(xiàn) 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL 兩種稀釋度的BTX-A化學(xué)性去神經(jīng)支配作用較強。

本研究發(fā)現(xiàn) 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL 兩種稀釋度BTX-A相比化學(xué)性去神經(jīng)支配作用沒有顯著性差異，這與Francisco等[10]、崔利華等[11]和王國棟等[12]的研究結(jié)果一致。而稀釋度為10.00U/0.1mL組雖有一定作用，但其趾運動評分在14天時恢復(fù)較為明顯，作用不及 2.50U/0.1mL、5.00U/0.1mL組，可能與其稀釋度過高導(dǎo)致擴(kuò)散較慢有關(guān)[9,13]。稀釋度為1.25U/0.1mL的BTX-A達(dá)不到最佳去神經(jīng)支配作用，與稀釋度過低使藥物穩(wěn)定性降低有關(guān)[9,14]。通常認(rèn)為，BTX-A在溫度過高或溶液過多時藥物易分解失效，稀釋度為1.25U/0.1mL時需要較多生理鹽水，導(dǎo)致BTX-A性狀改變而使毒素失去部分活性[15]。然而，也有研究認(rèn)為較低稀釋度的BTX-A藥物作用效果等同甚至優(yōu)于較高稀釋度的BTX-A。胡興越等[16]研究提示稀釋度為 1.7U/0.1mL 和 2.5U/0.1mL 的 BTX-A 效果相當(dāng)，羅蔚鋒等[17]認(rèn)為稀釋度為1.25U/0.1mL比稀釋度為5U/0.1mL的BTX-A肌肉松弛作用好，Kim等[14]比較了稀釋度為10U/0.1mL和2U/0.1mL BTX-A的肌肉松弛作用，發(fā)現(xiàn)后者效果較好。此結(jié)果可能與BTX-A稀釋后溶液量增多，影響了較多數(shù)量的運動終板，在較短時間內(nèi)與神經(jīng)肌肉接頭的膽堿能突觸前受體結(jié)合，抑制乙酰膽堿釋放，從而使肌肉松弛較明顯。

在局部肌肉注射治療肌張力障礙中，BTX-A發(fā)揮肌肉松弛作用與其稀釋度有關(guān)。藥物稀釋度過低，不能充分發(fā)揮其作用；而稀釋度過高，不利于藥物擴(kuò)散，且較易出現(xiàn)毒副作用。本研究發(fā)現(xiàn)，2.50U/0.1mL 和 5.00U/0.1mL BTX-A 局部注射起效快、維持作用時間長且去神經(jīng)支配作用強，它們可能是BTX-A局部注射合適的稀釋度。但是BTXA的作用維持時間一般為3～6個月[18]，本研究未在不同時間點對不同稀釋度BTX-A化學(xué)性去神經(jīng)支配效應(yīng)的動態(tài)變化進(jìn)行觀察，這是本研究的不足之處。本課題組將在下一步研究中選取不同時間點，動態(tài)觀察不同稀釋度BTX-A局部注射對小鼠神經(jīng)肌肉的影響，以期為臨床合理應(yīng)用BTX-A提供實驗依據(jù)。

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