秦 雯，鄭 超，王邦安，汪萌芽

(皖南醫(yī)學院 細胞電生理研究室，安徽 蕪湖 241002)

脊髓運動神經(jīng)元(motoneuron，MN)作為運動控制的“最后公路”，其活動依賴于多種通路的調(diào)控，包括外周傳入、各種下行通路和脊髓內(nèi)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)等［1－2］。已有研究表明，在新生大鼠脊髓切片MN，通過電刺激腹根［3］、同側(cè)背根［4－5］、同側(cè)［1，5－8］或?qū)?cè)腹外側(cè)索［9－10］均可在MN誘發(fā)突觸反應(yīng)，并觀察到興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)、抑制性突觸后電位(inhibitory postsynaptic potential，IPSP)以及EPSP復(fù)合 IPSP的反應(yīng)類型，不過這些都是脊髓外輸入通路的作用。脊髓內(nèi)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)對MN活動的調(diào)控，則以脊髓內(nèi)的中樞模式發(fā)生器(central pattern generator，CPG)最為重要［11］，譬如近年有研究報道表明［12－14］，位于脊髓同側(cè)中央管周圍區(qū)(ipsilateral pericentral canal，iPCC)的膽堿能V0C中間神經(jīng)元接受脊髓CPG等輸入，并通過其神經(jīng)末梢C型突觸終扣(C bouton)直接與MN建立突觸聯(lián)系，對MN活動提供了主要的膽堿能調(diào)制。不過，iPCC至MN神經(jīng)通路的突觸傳遞類型和細胞電生理特性，目前尚不清楚。因此，本文應(yīng)用新生大鼠脊髓切片MN細胞內(nèi)記錄技術(shù)，觀察iPCC局部電刺激在MN誘發(fā)的突觸反應(yīng)，并分析興奮性突觸反應(yīng)的基本電生理性質(zhì)和可能的介導遞質(zhì)，為進一步研究MN活動的脊髓內(nèi)調(diào)控、運動學習機制，以及可能的受體機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及脊髓切片制備 取8～14 d齡新生SD大鼠15只(由南京江寧青龍山動物繁殖場提供)，雌雄不拘。按報道方法，經(jīng)乙醚麻醉后分離出脊髓，用振蕩切片機(Vibratome，Technical Products International Inc，USA)制備脊髓腰骶膨大部的橫切片(400～500μm)厚片，置室溫(25±3)℃下經(jīng)95%O2和5%CO2混合氣體飽和的人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中備用。

1．2 細胞內(nèi)記錄及電刺激 用吸管將脊髓切片移入自制的全浸式記錄浴槽，用上下兩個絲網(wǎng)相夾固定，持續(xù)灌流經(jīng)混合氣體飽和的處于室溫(25±3)℃下的ACSF。取內(nèi)充3 mol/L乙酸鉀、尖端阻抗為80～140 MΩ的玻璃微電極，在顯微鏡下對脊髓腹角進行穿刺。記錄到的電信號由Axoclamp-2B微電極放大器(Axon Instruments，USA)放大后，經(jīng)DigiData 1200轉(zhuǎn)換接口(Axon)輸入計算機，用pClamp 7．0軟件(Axon)進行采樣、顯示和貯存。細胞內(nèi)電流注射由微機觸發(fā)，經(jīng)DigiData 1200聯(lián)機接口到微電極放大器后，刺激電流由探頭輸出經(jīng)微電極注入細胞內(nèi)。脊髓同側(cè)中央管周圍區(qū)(iPCC)局部電刺激和腹根電刺激(圖1)，由三通道電刺激器(日本光電)產(chǎn)生的方波脈沖，經(jīng)隔離器以恒壓模式至同芯雙極刺激電極施加。

1．3 藥物 Na+通道阻斷劑河豚毒素(TTX，Sigma)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體阻斷劑2-氨基-5-磷酸基戊酸(APV，Sigma)、γ-氨基丁酸A(GABAA)受體阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline，Sigma)、甘氨酸受體阻斷劑士的寧(strychnine，Sigma)，均用蒸餾水配成母液。非NMDA受體阻斷劑 6，7-二硝基喹諾林-2，3-二酮(DNQX，Sigma)用二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide，Sigma)溶解后，再用蒸餾水配成母液。臨用前以ACSF將藥物稀釋到所需濃度灌流給藥。低鈣高鎂溶液另外配置備用，即將ACSF配方中的Ca2+降至0．24 mmol/L，Mg2+升至 13 mmol/L，并降低 NaCl濃度以保持滲透壓不變。

1．4 分析方法 實驗記錄到的資料，用 Clampfit 10．1 軟 件 (Axon Instruments/Molecular Devices，USA)進行分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用 Origin 5．0軟件(Microcal Software Inc．，USA)，數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示。

2 結(jié)果

選取靜息電位(resting potential，RP)負于－60 mV且有超射的記錄穩(wěn)定、健康的細胞，通過加在脊髓腹根的同芯雙極刺激電極進行逆行激活，若記錄到具有全或無性質(zhì)的動作電位(action potential，AP)，即可鑒定為MN。本實驗對記錄到的14個MN，進行記錄分析，MN的基本電生理參數(shù)見表1。

圖1 脊髓切片和記錄方法VH:腹角;DH:背角;S1、S2分別表示腹根(VR)、同側(cè)中央管周圍區(qū)(iPCC)的刺激電極;R和A表示記錄微電極和放大器Fig 1 Illustration of spinal cord preparation and its recording techniquesVH:Ventral horn;DH:Dorsal horn;S1，S2:Stimulating electrode on ventral root(VR)，ipsilateral pericentral canal(iPCC)，respectively;R and A:Intracellular recording microelectrode and its amplifier

表1 新生大鼠脊髓切片MN基本電生理參數(shù)(ˉx±s，n=14)Tab 1 Electrophysiological parameters of motoneurons in neonatal rat spinal cord slices(ˉx±s，n=14)

2．1 iPCC局部電刺激誘發(fā)的突觸反應(yīng) 實驗中對記錄到的14個MN，進行iPCC的局部恒壓電刺激(0．1 ～0．2 ms，20 ～100 V，0．2 Hz)，結(jié)果在 11 個(78．6%)MN記錄到去極化反應(yīng)(iPCC-EPSP)，在1個(7．1%)MN記錄到超極化反應(yīng)(iPCC-IPSP)，在2個(14．3%)MN記錄到 iPCC-EPSP后復(fù)合有iPCC-IPSP的綜合反應(yīng)(圖2)，其中閾刺激誘發(fā)的iPCC-EPSP的細胞電生理參數(shù)列于表2。

圖2 同側(cè)中央管周圍區(qū)(iPCC)局部電刺激在離體脊髓MN記錄到的3種突觸反應(yīng)A:興奮性突觸后電位(iPCC-EPSP)，RP為－61 mV;B:抑制性突觸后電位(iPCC-IPSP)，RP為 － 65 mV;C:iPCC-EPSP復(fù)合 i PCC-IPSP的突觸反應(yīng)，RP為－75 mV。箭頭所指為iPCC局部電刺激偽跡Fig2 Distinct synaptic responses recorded in MN by focal stimulation of ipsilateral pericentral canal(iPCC)in spinal cord slicesA:Excitatory postsynaptic potential(iPCC-EPSP)in an MN with RP of－61 mV;B:Inhibitory postsynaptic potential(iPCC-IPSP)in an MNwith RP of－65 mV;C:iPCC-IPSP preceded by iPCC-EPSP in an MN with RPof －75 mV．The arrow indicates iPCCfocal stimulus artifact

表2 離體脊髓運動神經(jīng)元閾刺激誘發(fā)iPCC-EPSPs的細胞電生理參數(shù)(ˉx±s，n=11)Tab 2 Cellular electrophysiological parameters of iPCC-EPSPs evoked by threshold stimuli in MN in vitro(ˉx±s，n=11)

2．2 iPCC-EPSP的細胞電生理特性 對記錄到的iPCC-EPSP，改變刺激強度或膜電位水平可觀察到幅度具有刺激強度依賴性和膜電位依賴性(圖3)，給予低鈣高鎂溶液或0．1μmol/L TTX灌流15 min后，可逆性取消iPCC-EPSP，表明iPCC-EPSP是化學性突觸傳遞(圖4)。

2．3 iPCC-EPSP的藥理學性質(zhì) 在記錄到iPCCEPSP的 MN，給予 NMDA受體阻斷劑 APV(30 μmol/L)，顯示了對iPCC-EPSP的部分抑制作用，再給予非NMDA受體阻斷劑DNQX(1μmol/L)，觀察到iPCC-EPSP被進一步抑制，但未能完全被取消，其作用可被ACSF部分洗出(圖5)。進一步觀察抑制性氨基酸受體阻斷劑對iPCC-EPSP的影響，結(jié)果表明荷包牡丹堿(30μmol/L)和士的寧(1μmol/L)均可增大iPCC-EPSP，在其基礎(chǔ)上再給予APV(30 μmol/L)和 DNQX(1μmol/L)，同樣僅具有部分抑制iPCC-EPSP的作用，未能完全取消iPCC-EPSP(n=4)，該作用可被ACSF部分洗出(圖6)。

圖3 iPCC-EPSP的刺激強度依賴性和膜電位依賴性A:iPCC-EPSP的刺激強度依賴性(T:閾強度，數(shù)字表示其倍數(shù))，RP為－72 mV;B:iPCC-EPSP的膜電位依賴性，數(shù)字表示膜電位，RP為－63 mV。箭頭所指為iPCC局部電刺激偽跡Fig 3 Stimulus intensity-and membrane potential-dependent properties of iPCC-EPSPin MN in vitroA:iPCC-EPSP could be graded by varying the stimulus intensity in an MN with RP of －72 mV;T:Threshold intensity of stimulus，the numerals indicate times of T;B:Membrane potential(MP)-dependent property of iPCC-EPSPin an MN with RPof －63 mV．Numbers to the left of each trace are MPs．The arrows indicate iPCC focal stimulus artifacts

3 討論

本文首先通過對脊髓切片iPCC施加局部電刺激，在全部測試的14個MN均記錄到突觸反應(yīng)，說明脊髓iPCC部位的中間神經(jīng)元與MN之間存在著比較確切的突觸聯(lián)系。盡管記錄到的突觸反應(yīng)有iPCC-EPSP、iPCC-IPSP和 iPCC-EPSP后復(fù)合 iPCCIPSP三種類型，但在大部分MN誘發(fā)的是iPCC-EPSP，并具有刺激強度依賴性和膜電位依賴性，且可以被低鈣高鎂溶液和TTX可逆性取消，說明在本文的背景實驗條件下，iPCC向MN的突觸傳入是興奮性化學突觸傳遞占優(yōu)勢，這與報道的形態(tài)學結(jié)果［2，13－14］、運動控制相關(guān)實驗結(jié)果相吻合［15］。不過，從可以記錄到iPCC-IPSP和iPCC-EPSP后復(fù)合iPCC-IPSP兩種類型的突觸反應(yīng)，特別是抑制性氨基酸受體阻斷劑畢扣扣靈和士的寧可明顯增大iPCC-EPSP的結(jié)果，可以看出在MN活動的背景抑制性調(diào)控中，可能有較大的成分來源于iPCC-MN通路，這值得進一步研究。

圖4 低鈣高鎂溶液或TTX(0．1μmol/L)對iPCC-EPSP的影響A和B為來自同一MN的記錄，RP為－63 mV。箭頭所指為iPCC局部電刺激偽跡Fig 4 Effects of low Ca2+/high Mg2+solution or tetrodotoxin(TTX，0．1 μmol/L)on iPCC-EPSPsA and B are recordings from the same MN with RP of －63 mV．The arrows indicate iPCCfocal stimulus artifacts

圖5 谷氨酸受體阻斷劑APV和DNQX對iPCC-EPSP的影響NMDA受體阻斷劑APV(30μmol/L)和非NMDA受體阻斷劑DNQX(1μmol/L)灌流15 min可部分抑制iPCC-EPSP。RP為－78 mV，箭頭所指為iPCC局部電刺激偽跡Fig 5 Effects of glutamate receptor antagonists APV and DNQX on iPCC-EPSP in an MNBoth of NMDA receptor antagonist APV(30μmol/L)and non-NMDA receptor antagonist DNQX(1μmol/L)could partially inhibited iPCC-EPSP．RP was －78 mV．The arrow indicates iPCC focal stimulus artifact

在實驗中觀察到的最主要現(xiàn)象是iPCC-EPSP的特殊藥理學性質(zhì)，即在有背景抑制性輸入，或用GABAA受體阻斷劑畢扣扣靈和甘氨酸受體阻斷劑士的寧取消iPCC-IPSP成分或背景抑制性輸入情況下，促離子型谷氨酸受體阻斷劑，包括NMDA受體阻斷劑APV和非NMDA受體阻斷劑DNQX，均只能部分抑制iPCC-EPSP，不能完全取消，說明在iPCC局部電刺激誘發(fā)的興奮性突觸傳遞中，除了谷氨酸通過NMDA受體和非NMDA受體參與介導外，還可能有其他的興奮性遞質(zhì)的參與，這與已經(jīng)報道的外周傳入、下行激活通路向MN的興奮性突觸傳遞不同［1，3－10］。至于對 APV 和 DNQX 不敏感成分的來源，在排除了抑制性氨基酸和谷氨酸的促離子型受體后，仍然有多種可能性，包括興奮性或抑制性谷氨酸其他類型受體、其他神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、5-羥色胺等，如該部位存在的膽堿能V0c中間神經(jīng)元通過C型突觸終扣向MN的膽堿能突觸傳遞就是一個重要候選機制［12，16，18］，這需要進一步的實驗來證明。

圖6 抑制性氨基酸受體阻斷劑和谷氨酸受體阻斷劑對iPCC-EPSP的影響在荷包牡丹堿(bicuculline，30 μmol/L)和士的寧(strychnine，1 μmol/L)阻斷了抑制性氨基酸受體、明顯增大iPCC-EPSP的條件下，APV(30μmol/L)和DNQX(1μmol/L)仍然呈現(xiàn)部分抑制iPCC-EPSP的作用。RP為－63 mV，箭頭所指為iPCC局部電刺激偽跡Fig 6 Effects of inhibitory amino acid receptor antagonists and glutamate receptor antagonists on iPCC-EPSP in an MNAfter enlargement of iPCC-EPSPby pretreatment of inhibitory amino acid receptor antagonists bicuculline(30 μmol/L)and strychnine(1 μmol/L)，glutamate receptor antagonists APV(30 μmol/L)and DNQX(1 μmol/L)could only partially inhibit iPCC-EPSP．RP was －63 mV．The arrow indicates iPCC focal stimulus artifact

對于iPCC-MN通路突觸傳遞的復(fù)雜性，還需要考慮的另一個重要因素就是iPCC局部刺激可能激活的成分或具體通路，可以涉及該部位的不同神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元、不同神經(jīng)遞質(zhì)的纖維，以及可能在iPCC-MN間存在的中間神經(jīng)元等。如已報道的膽堿能V0c中間神經(jīng)元通過C型突觸終扣與MN聯(lián)系，而V0c中間神經(jīng)元接受來自腦干的下行輸入、同側(cè)感覺輸入以及CPG的節(jié)律性輸入，其中70%傳遞到同側(cè) MN［12］。Miles 和 Muennich 等［18－19］發(fā)現(xiàn)MN接受來自中央管周圍區(qū)V0c中間神經(jīng)元的C型突觸終扣上膽堿能受體的調(diào)控，激活M2-AChR可降低動作電位后超極化的幅度從而增強MN的興奮性，并且M2-AChR的傳入可增加在節(jié)律性活動中MN的興奮性。某些脊髓病變，例如萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，其 MN的興奮性明顯改變。Herron等［20］發(fā)現(xiàn)在ALS的早期階段C型突觸終扣增大，而這種改變僅在雄性小鼠身上出現(xiàn)，提示C型突觸終扣功能紊亂參與了雄性動物ALS的形成。另外有報道［21］，脊髓損傷后MN的興奮性升高，表現(xiàn)為NMDA受體與膽堿能系統(tǒng)上調(diào)，而GABAA系統(tǒng)下調(diào)，提示NMDA受體與膽堿能系統(tǒng)在癱瘓癥的功能恢復(fù)中可能具有積極的協(xié)同作用。由此可見，不僅iPCC-MN通路突觸傳遞的神經(jīng)遞質(zhì)是值得進一步研究的重要內(nèi)容，同時也具有重要的生物學和臨床意義。

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